基因敲除效果的檢測(cè)
服務(wù)介紹
CRISPR/Cas9是繼鋅指核酸酶(ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALEN)以來(lái)的第3代基因編輯技術(shù)。該技術(shù)自2013年迎來(lái)了高速發(fā)展時(shí)代。它利用含有與靶基因同源的sgRNA與Cas9共同作用切割靶基因。在基因敲除實(shí)驗(yàn)中，由于gRNA所介導(dǎo)的基因敲除效率難以預(yù)料，因此，高效gRNA的選擇對(duì)于成功敲除基因是非常關(guān)鍵的。為了提高切割效率，科研工作者通常會(huì)設(shè)計(jì)3-5條gRNA，并篩選高效gRNA。無(wú)論是特異gRNA敲除效果的檢測(cè)，還是高效gRNA的篩選，科研工作者均需要通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。維真生物可根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求提供個(gè)性化的基因敲除效果檢測(cè)服務(wù)。
服務(wù)內(nèi)容
維真生物可采取多種方法幫客戶檢測(cè)特異gRNA敲除效果和篩選高效gRNA，具體信息詳見下表：
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服務(wù)編號(hào)
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服務(wù)類型
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規(guī)格
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目錄價(jià)
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貨期
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WZ100001-1
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特異gRNA沉默效果檢測(cè)
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熒光檢測(cè) 推薦！ 直接克隆測(cè)序
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詢價(jià)
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咨詢
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WZ100001-2
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特異gRNA沉默效果檢測(cè)
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PCR產(chǎn)物測(cè)序
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詢價(jià)
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咨詢
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WZ100002-1
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高效gRNA篩選
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熒光檢測(cè) 推薦！ 直接克隆測(cè)序
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詢價(jià)
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咨詢
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WZ100002-2
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高效gRNA篩選
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PCR產(chǎn)物測(cè)序
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詢價(jià)
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咨詢
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*如您對(duì)上述服務(wù)感興趣，請(qǐng)您點(diǎn)擊“歡迎垂詢”留下您的信息，我們將為您提供具體實(shí)驗(yàn)方案和項(xiàng)目?jī)r(jià)格。
相關(guān)服務(wù)： CRISPR-Cas9克隆 腺病毒包裝 慢病毒包裝 腺相關(guān)病毒包裝 KO細(xì)胞系建立
熒光法檢測(cè)敲除效果特色！
敲除效果的常規(guī)檢測(cè)方法是PCR產(chǎn)物測(cè)序的定性法和直接克隆測(cè)序的定量法。這兩種方法受細(xì)胞類型的限制，它們是在基因組水平進(jìn)行測(cè)量，故結(jié)果真實(shí)度比較高。盡管如此，它們?cè)诓僮?、?shí)驗(yàn)周期和檢測(cè)細(xì)胞類型方面就顯得遜色。為了克服這些問(wèn)題，維真生物建立了一套簡(jiǎn)捷和可重復(fù)的基因敲除效果檢測(cè)系統(tǒng)——熒光法。
設(shè)計(jì)策略
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優(yōu)勢(shì)
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1. 操作簡(jiǎn)單；
2. 周期短，通常3個(gè)工作日即可完成；
3. 敲除效果檢測(cè)不受細(xì)胞類型的限制；
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4. 敲除效果直觀、明了，通過(guò)EGFP是否發(fā)光檢測(cè)敲除效果的發(fā)生；通過(guò)EGFP的發(fā)光強(qiáng)度定性敲除效率；
5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠、重復(fù)性好。
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下圖是根據(jù)某基因設(shè)計(jì)多條gRNA序列，將pKO-Reporter和gRNA、Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293，48h后觀察的熒光結(jié)果：
PCR產(chǎn)物測(cè)序、直接克隆測(cè)序和熒光法的比較
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檢測(cè)方法
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周期
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定性/定量
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真實(shí)度
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細(xì)胞類型受限性
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PCR產(chǎn)物測(cè)序
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較短，4-5個(gè)工作日
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定性，根據(jù)套峰情況判斷敲除效果和效率
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好，基因組位點(diǎn)切割
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受限制
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直接克隆測(cè)序
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長(zhǎng)，10-15個(gè)工作日
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定量，可計(jì)算敲除效率
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好，基因組位點(diǎn)切割
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受限制
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熒光法
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短，3個(gè)工作日
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定性，根據(jù)熒光情況判斷敲除效果和效率
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較好，切割位點(diǎn)在外源質(zhì)粒
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不受限制
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服務(wù)流程
相關(guān)資料
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TALEN
Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶是具有序列特異性的限制性內(nèi)切酶，通過(guò)融合類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物（TALE）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)DNA雙鏈的斷裂，借助宿主細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制，通過(guò)同源重組或非同源性末端連接 (NHEJ)進(jìn)行DNA修復(fù)，從而產(chǎn)生Indel基因編輯效果。其作用原理見下圖：
TALE(TAL effectors，類激活因子效應(yīng)物)：
TALE是植物病原菌黃單胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白，能夠識(shí)別特異性DNA堿基對(duì)。
設(shè)計(jì)策略：
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優(yōu)勢(shì)
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1. 維真生物擁有一整套四聚體克隆，直接用來(lái)組裝18堿基重復(fù)單元；
2. 可提供各種病毒載體；
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3. 克隆全部經(jīng)過(guò)全長(zhǎng)序列測(cè)序；
4. 可提供敲除效果驗(yàn)證附加服務(wù)。
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應(yīng)用示例——腺相關(guān)病毒在人源基因組中整合位點(diǎn)AAVS1的基因編輯
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TANLEN & CRISPR Cas9的區(qū)別
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比較項(xiàng)
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TALEN
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CRISPR-CAS9
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識(shí)別靶序列模式
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Protein-DNA
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RNA-DNA
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匹配靶序列模塊
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一個(gè)RVD(重復(fù)可變雙殘基)識(shí)別單個(gè)堿基
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RNA-DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)
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靶序列堿基數(shù)
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>16bp *2
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~20bp
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脫靶率
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低
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有潛在脫靶性
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多個(gè)基因同時(shí)敲除
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不可以
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可以
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甲基化敏感
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敏感
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不敏感
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適用物種
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廣泛
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廣泛
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