近年來，RNAi已成為研究基因功能不可或缺的工具。其應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)從基因組學(xué)研究逐步擴(kuò)展到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域并作為基因治療手段。RNAi作為這么重要的分子生物學(xué)技術(shù)，其原理如何？如下圖所示：外源dsRNA進(jìn)入細(xì)胞后在Dicer酶的作用下產(chǎn)生雙鏈siRNA，雙鏈siRNA解旋后，其反義鏈和多種核酸酶形成了沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用，從而介導(dǎo)RNA干擾的過程。
根據(jù)RNAi的作用機(jī)制，RNAi實(shí)驗(yàn)的研究步驟大體分為4步，詳見下圖：
除了化學(xué)合成siRNAs外，維真生物可以提供Vector-based shRNAs構(gòu)建、導(dǎo)入細(xì)胞和抑制效果驗(yàn)證服務(wù)，功能驗(yàn)證服務(wù)需要根據(jù)客戶的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行現(xiàn)場評(píng)估。RNAi的效應(yīng)分子是siRNA。不管您選擇什么干擾方式，最終均會(huì)形成siRNA，然后與RISC多蛋白復(fù)合物組裝成有活性的RISC，發(fā)揮基因沉默功能。*shRNA(short hairpin RNA)，即短發(fā)卡RNA，是可以克隆至表達(dá)載體并表達(dá)siRNA雙鏈的RNA分子；siRNA(small interfering RNA)，即小干擾RNA，是21-23nt的雙鏈RNA復(fù)合物，每條鏈的3’端有2-3個(gè)突出的非配對堿基且3’端為羥基，5’端為磷酸，這個(gè)結(jié)構(gòu)具有能被Rnase Ⅲ樣活性的核酸酶識(shí)別切割的特征，從而引發(fā)高度保守的Dicer 家族的RNaseⅢ的識(shí)別作用進(jìn)而特異切割dsRNA產(chǎn)生基因沉默作用。下面是siRNA(上圖)和shRNA(下圖)的結(jié)構(gòu)示意圖：
siRNA與shRNA都可以有效沉默或抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，但是作用機(jī)制還是有一些區(qū)別的，具體內(nèi)容詳見下圖：
siRNA和shRNA的區(qū)別：
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比較項(xiàng)
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shRNA
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siRNA
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穩(wěn)定性
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高
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低、容易降解，壽命短
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作用時(shí)效
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作用時(shí)間較長，持續(xù)數(shù)星期甚至更長
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作用時(shí)間較短，一般為1周左右
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脫靶率
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低
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高
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導(dǎo)入細(xì)胞方式
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質(zhì)粒載體，普通轉(zhuǎn)染；病毒導(dǎo)入，克服轉(zhuǎn)染困難細(xì)胞的導(dǎo)入；
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普通轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染困難細(xì)胞的細(xì)胞難轉(zhuǎn)染
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表達(dá)方式
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聚合酶II型和III型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)；可使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)；
可以與報(bào)告基因共表達(dá)，可視化細(xì)胞導(dǎo)入效率
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直接化學(xué)合成
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抑制效果檢測時(shí)間
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取決于靶蛋白的半衰期
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Vector-based shRNAs，多數(shù)由聚合酶III型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。常見的聚合酶III型啟動(dòng)子包括U6和H1，這類啟動(dòng)子缺少組織特異性，主要用來啟動(dòng)比較短的RNA，且末端需要4-6個(gè)連續(xù)的T來終止轉(zhuǎn)錄。下面是Vector-based shRNAs的結(jié)構(gòu)示意圖：
關(guān)于Vector-based shRNAs，為了滿足廣大科研工作者不同的實(shí)驗(yàn)需求，維真生物可以提供多種shRNA質(zhì)粒構(gòu)建服務(wù)：
單個(gè)shRNA載體構(gòu)建，客戶提供高效siRNA靶點(diǎn)，維真生物公司根據(jù)靶點(diǎn)構(gòu)建shRNA質(zhì)粒。
套餐shRNA質(zhì)粒構(gòu)建，維真生物根據(jù)客戶提供的靶基因信息構(gòu)建3保1或者4保1 shRNA質(zhì)粒。
多和1 shRNA載體構(gòu)建特色1，維真生物根據(jù)客戶提供的高效siRNA靶點(diǎn)和靶基因信息構(gòu)建多和1 shRNA質(zhì)粒。
以4 in 1 shRNA為例：該服務(wù)是將4條shRNA序列克隆至1個(gè)shRNA質(zhì)粒。維真生物的4 in 1 shRNA質(zhì)粒不僅可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可包裝成病毒用于病毒導(dǎo)入宿主。
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4 in 1 shRNA下調(diào)GFP表達(dá)
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4 in 1 shRNA下調(diào)RCAN1表達(dá)
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優(yōu)勢
1）將4個(gè)作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆進(jìn)同一shRNA載體，增加了目的基因下調(diào)表達(dá)的概率。
2）將高效的、作用于2-4個(gè)靶基因的shRNA序列克隆進(jìn)同一shRNA載體，實(shí)現(xiàn)2-4個(gè)基因同時(shí)下調(diào)表達(dá)的目的。
3）無需序列篩選，大大減少實(shí)驗(yàn)工作量。
4）多種4 in 1 shRNA病毒載體的選擇，包括腺病毒穿梭載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體，實(shí)現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?
劣勢
針對同一目的基因的4條shRNA序列，不能具體確定哪條shRNA序列的干擾效果最好。
mir30-based shRNA質(zhì)粒構(gòu)建特色2，實(shí)現(xiàn)組織特異性基因沉默。
shRNA的RNAi機(jī)制與microRNA成熟機(jī)制一樣，因此，shRNA也可以由聚合酶II型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。這類啟動(dòng)子包括廣譜啟動(dòng)子(如CMV、CAG和EF1a等)和組織特異性啟動(dòng)子(如hSyn、TBG和cTnT等)，可以啟動(dòng)較大的基因轉(zhuǎn)錄，且需要polyA等轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。維真生物可以根據(jù)客戶指定的啟動(dòng)子和提供的shRNA序列將其構(gòu)建至mir30-based shRNA質(zhì)粒。mir30-based shRNA結(jié)構(gòu)示意圖如下：
誘導(dǎo)性shRNA質(zhì)粒構(gòu)建特色3，包括Cre/loxp，F(xiàn)lp/Frt和Tet on等誘導(dǎo)系統(tǒng)。
以Cre on shRNA為例，該服務(wù)是使用FLEX(flip-excision)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)shRNA誘導(dǎo)表達(dá)。FLEX是一種非常強(qiáng)大的控制基因表達(dá)的方法，它采用2對異質(zhì)、反向的loxp位點(diǎn)(loxP和lox2272)，經(jīng)過DNA翻轉(zhuǎn)產(chǎn)生帶有不同loxp位點(diǎn)的DNA翻轉(zhuǎn)，防止進(jìn)一步的DNA翻轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因不可逆的翻轉(zhuǎn)。維真生物采用改良版FLEX，將2對異質(zhì)、反向的loxp位點(diǎn)置于啟動(dòng)子兩邊，通過cre作用決定啟動(dòng)子方向，通過不同熒光蛋白可視化shRNA的表達(dá)。
1. 維真生物載體的啟動(dòng)子是哪些？
維真生物載體使用兩類啟動(dòng)子：人源的U6啟動(dòng)子和H1啟動(dòng)子。
2. 人源的U6啟動(dòng)子和H1啟動(dòng)子是否可以應(yīng)用于大鼠、小鼠或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中？
可以的。人源的U6啟動(dòng)子和H1啟動(dòng)子之間沒有物種差別。這些啟動(dòng)子在大鼠、小鼠或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的啟動(dòng)效率也非常好。
3. 你們保證siRNA干擾載體的效果嗎？
如果針對一條被干擾的基因設(shè)計(jì)三條或四條shRNA，維真生物承諾在客戶細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上的條件下，如果3個(gè)或者4個(gè)靶點(diǎn)shRNA沒有任何一個(gè)對靶基因的抑制效率在mRNA水平上達(dá)到70%以上，公司將免費(fèi)重新設(shè)計(jì)并構(gòu)建4個(gè)新的shRNA質(zhì)粒，需要增加一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。若重新構(gòu)建的shRNA載體仍然沒有任何一個(gè)對靶基因mRNA的抑制效率能夠達(dá)到70%，可能和該基因有關(guān)，公司僅收取客戶單次shRNA載體構(gòu)建費(fèi)用。
4. 針對一條被干擾的基因，你們建議訂購幾個(gè)干擾載體？
針對一條被干擾的基因，我們建議至少構(gòu)建3個(gè)干擾載體。
5.我如何監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率？
您可以采用維真生物帶有GFP標(biāo)記的shRNA載體直接地監(jiān)控轉(zhuǎn)染效率。
6. 維真生物能夠利用來自其它公司的載體構(gòu)建vector-based shRNA載體嗎？
可以，不過需要您提供給我們載體。
7. Vector-based shRNA的交付周期為多久？
交付周期為2-3周。
8. 使用病毒感染細(xì)胞的優(yōu)勢是什么？
病毒介導(dǎo)的shRNA可以克服一些由于靶細(xì)胞影響RNAi的問題，如原代細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率低。
