CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系統(tǒng)是細(xì)菌在噬菌體長期選擇壓力下，進(jìn)化出的一種有效的獲得性免疫機(jī)制。
CRISPR簇廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族。其由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)（leader）、多個(gè)重復(fù)序列區(qū)（repeat）和多個(gè)間隔區(qū)（spacer）構(gòu)成。前導(dǎo)區(qū)被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動(dòng)子，重復(fù)序列區(qū)可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，間隔區(qū)由俘獲的外源DNA組成。
CRISPR簇附近存在一個(gè)多態(tài)性家族基因，編碼的蛋白質(zhì)均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性，并能與CRISPR區(qū)域發(fā)生相互作用，被命名為Cas（CRISPR associated）基因。
當(dāng)外源DNA入侵時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體（pre-CRISPR RNA， pre-crRNA），并通過加工成為一系列含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，然后識別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。
CRISPR/Cas9作用原理
根據(jù)Cas蛋白質(zhì)和參與序列的不同，將目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型需要多種Cas蛋白共同發(fā)揮作用，而Ⅱ型由Cas9單獨(dú)參與，是研究較為深入的一種類型。
在pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）也轉(zhuǎn)錄出來。Cas9首先與crRNA和tracrRNA結(jié)合形成復(fù)合物，此復(fù)合物通過與PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-蛋白-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在與crRNA配對的序列靶點(diǎn)剪切雙鏈DNA。
通過人工設(shè)計(jì)這兩種RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（single guide RNA），通過將表達(dá)sgRNA的元件與表達(dá)Cas9的元件相連接，得到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒，便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作，以引導(dǎo)Cas9對DNA的定點(diǎn)切割。
CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用原理（Zhang Feng，2013）
CRISPR/Cas9系統(tǒng)元件
CRISPR/Cas9系統(tǒng)需要兩個(gè)關(guān)鍵基因序列：gRNA和Cas9，gRNA的功能是識別目的DNA序列，并引導(dǎo)Cas9蛋白到目的基因序列處進(jìn)行切割。gRNA序列由兩部分組成：能夠與目的基因匹配的序列和能夠與Cas9蛋白結(jié)合的序列。Cas9是一種能切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，在匹配的基因的PAM序列的上游3-4堿基處進(jìn)行DNA雙鏈的切割。
spCas9 & saCas9
根據(jù)PAM序列的不同，Cas9分為spCas9和saCas9兩種。
saCas9基因序列長約3.3kb，spCas9基因序列長約4.1kb，因?yàn)閟aCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更為容易，且saCas9更適宜包裝成AAV病毒，當(dāng)然兩者都可以包裝成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一個(gè)很大的區(qū)別是兩者識別的PAM序列不同，saCas9識別的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9識別的PAM序列為5’-NGG-3’,因?yàn)閟aCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列長，在基因組中出現(xiàn)的概率更低，相比于spCas9脫靶率要低，其gRNA設(shè)計(jì)也相對更困難。
1. 服務(wù)項(xiàng)目全：維真生物可以提供從gRNA序列設(shè)計(jì)、gRNA質(zhì)粒構(gòu)建、高效gRNA序列篩選、病毒包裝和細(xì)胞系建立等多種靈活性服務(wù)，以滿足科研工作者不同的實(shí)驗(yàn)需求；
2. 服務(wù)種類多：維真生物可以提供單gRNA質(zhì)粒構(gòu)建，多合1 gRNA質(zhì)粒構(gòu)建和gRNA pool & gRNA mix質(zhì)粒構(gòu)建；
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4 gRNA mix質(zhì)粒構(gòu)建特色！—— 保證有效 & 選擇性多
該服務(wù)是將4條gRNA序列克隆至Cas9 + gRNA all in one慢病毒質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒不僅可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可包裝成慢病毒。但是，考慮到重組載體比較大對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄效率的影響，我們強(qiáng)烈推薦您直接選擇慢病毒成品。
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4 gRNA(for hAKT1) mix在HEK293中的敲除效果比較(左：測序結(jié)果；右：編輯效率)
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gRNA pool質(zhì)粒構(gòu)建特色！—— 編輯效率大大提高
維真生物采用特殊的生產(chǎn)工藝針對同一基因構(gòu)建gRNA pool質(zhì)粒，大大提高了目的基因的編輯效率。
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3. 質(zhì)粒數(shù)量多：維真生物可以提供單載體、雙載體；腺病毒載體、慢病毒載體和AAV 載體；不同報(bào)告基因EGFP和RFP，不同真核抗性篩選基因puro和Blat、cre功能基因質(zhì)粒。
示例：AAV常用載體：
