IF 39.3｜李旭日/曹義海/趙晨研究團隊揭示VEGF-B防止血管過度生成的潛在機制！
VEGF-B是VEGF-A的同源物，在血管內(nèi)皮細胞(ECs)和許多其他細胞類型中高度表達。不同的研究報道了VEGF-B的各種作用，但其在血管系統(tǒng)中的具體作用仍不甚明了。2023年8月18日，中山大學中山眼科中心李旭日教授，瑞典卡羅林斯卡研究院曹義海教授聯(lián)合復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院趙晨教授在“Signal Transduction and Targeted Therapy,IF 39.3”上發(fā)表了題為VEGF-B prevents excessive angiogenesis by inhibiting FGF2/FGFR1 pathway的研究論文。文章首次闡明VEGF-B結合FGFR1，誘導FGFR1/VEGFR1復合物的形成，從而抑制FGF2/FGFR1介導的Erk激活、血管生成以及腫瘤生長，揭示了VEGF-B作為抗血管生成因子的新功能。
維真生物助力：腺病毒
研究結果
1、VEGF-B與FGFR1特異性結合
作者利用人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞( HRECs )篩選了一個磷酸化受體酪氨酸激酶( pRTK )抗體陣列，發(fā)現(xiàn)VEGF-B可能與FGFR1相互作用；進一步檢測發(fā)現(xiàn)VEGF-B與FGFR1特異性結合。接下來，作者研究了VEGF-B結合的FGFR1細胞外結構域，并生成了FGFR1不同細胞外結構域(D)的重組蛋白:FGFR1 DI、DII、DIII、DI-II和DII-III。利用過表達FGFR1的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的細胞遷移實驗驗證這些重組蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)FGFR1 DII-III減少了FGF2誘導的細胞遷移，而FGFR1 DIII沒有。SPR分析和單結構域結合實驗均顯示VEGF-B與FGFR1 DIII和DII結合的KD值與FGF2相似，表明VEGF-B主要結合FGFR1結構域II和III。進一步研究發(fā)現(xiàn)VEGF-B與FGF2競爭FGFR1結合，并且VEGF-B可能通過競爭FGFR1結合來抑制FGF2的功能。
圖1. VEGF-B與FGFR1結合，并與FGF2競爭FGFR1結合
2、VEGF-B誘導VEGFR1/FGFR1復合物形成
鑒于VEGF-B與VEGFR1和FGFR1結合，作者探討了VEGF-B是否可以誘導VEGFR1/FGFR1復合物的形成。IP和WB結果顯示，VEGFR1與FGFR1在小鼠腦、肺、心臟等組織中共免疫沉淀，證明存在天然的內(nèi)源性VEGFR1/FGFR1復合物。重要的是，在小鼠眼睛玻璃體內(nèi)注射VEGF-B會增加視網(wǎng)膜中VEGFR1/FGFR1復合物的數(shù)量，而用胎盤生長因子（PlGF）處理則沒有。為了直接觀察FGFR1/VEGFR1復合物，作者使用同時表達VEGFR1和FGFR1的HRECs進行了原位近距離連接實驗，發(fā)現(xiàn)VEGF-B處理增加了FGFR1與VEGFR1的關聯(lián)，而PlGF沒有，表明VEGF-B的作用是特異性的。體內(nèi)和體外實驗表明，VEGF-B誘導FGFR1/VEGFR1復合物的形成。此外，VEGF-B以高親和力結合VEGFR1/FGFR1異源二聚體。
圖2. VEGF-B誘導VEGFR1/FGFR1復合物形成
3、VEGF-B抑制FGF2誘導的Erk活化
為研究VEGF-B誘導的下游信號，作者使用不同類型的內(nèi)皮細胞篩選了磷酸化激酶抗體陣列，發(fā)現(xiàn)VEGF-B降低了人皮膚微血管內(nèi)皮細胞1（HMEC1）、HRECs和HUVECs中的Erk磷酸化，驗證發(fā)現(xiàn)VEGF-B的抑制作用是特異性的，VEGF-B對FGF2誘導的FGFR1激活的抑制作用在小鼠視網(wǎng)膜的體內(nèi)也得到了證實。作者進一步用苯丙氨酸(F)分別代替FGFR1的六個酪氨酸(Y)，產(chǎn)生了一系列的定點突變。VEGF-B在表達野生型FGFR1 (WT-FGFR1)和FGFR1-F766, FGFR1-F654和FGFR1-F583突變體的細胞中抑制了FGF2誘導的Erk磷酸化，但在表達FGFR1-F463, FGFR1-F585和FGFR1-F653突變體的細胞中未發(fā)現(xiàn)該抑制作用，表明酪氨酸殘基Y463, Y585和Y653對VEGF-B的抑制作用很重要。利用腺病毒（維真助力）在HUVECs中過表達野生型FGFR1和Y463F, Y585F和Y653F突變體，結果發(fā)現(xiàn)VEGF-B在過表達FGFR1 WT的HUVECs中增加了VEGFR1/FGFR1復合物的形成，但在過表達FGFR1 Y463F、FGFR1 Y585F或FGFR1 Y653F突變體的HUVECs中沒有增加，表明酪氨酸殘基Y463、Y585和Y653在介導VEGF-B誘導的VEGFR1/FGFR1復合物形成中的作用。以上體內(nèi)外數(shù)據(jù)均表明VEGF-B對FGF誘導的Erk活化具有抑制作用。
圖3. VEGF-B抑制FGF2誘導的Erk活化
4、VEGF-B抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長
接下來，作者探究了VEGF-B是否影響FGF2的血管生成活性。體內(nèi)皮下Matrigel實驗顯示，VEGF-B抑制了FGF2誘導的血管生成，而PlGF則沒有作用。利用表達高水平FGF2的小鼠T241纖維肉瘤細胞進一步驗證了VEGF-B抗血管生成作用的體內(nèi)相關性，發(fā)現(xiàn)T241-FGF2細胞在VEGF-B?/?小鼠中形成了更大的腫瘤，腫瘤血管生成增加。綜上實驗結果表明VEGF-B對FGF2介導的功能有抑制作用。進一步驗證發(fā)現(xiàn)VEGFR1和FGFR1是VEGF-B發(fā)揮抑制作用所必需的。
圖4. VEGF-B抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長
小結
本研究發(fā)現(xiàn)VEGF家族成員VEGF-B在高FGF2/FGFR1水平的條件下，通過抑制FGF2/FGFR1途徑發(fā)揮抗血管生成因子的作用。在機制上，VEGF-B與FGFR1結合，誘導FGFR1/VEGFR1復合物形成，抑制FGF2誘導的Erk激活，從而抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長。本研究揭示了VEGF-B作為FGF2/FGFR1途徑內(nèi)源性抑制劑的新功能。
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