Cell Death & Disease (IF 9.0)｜山東省腫瘤醫(yī)院張松團(tuán)隊揭示METTL3在結(jié)直腸癌中的致癌機制
N6-甲基腺苷（m6A）是一種在哺乳動物信使RNA中普遍存在的內(nèi)部修飾，占RNA修飾的80%以上。據(jù)報道，m6A修飾涉及一系列生物學(xué)過程，包括干細(xì)胞自我更新和分化、DNA損傷修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)、性別決定等。除了正常的生理活動外，m6A還與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)。METTL3是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，具有致癌作用，已知由METTL3介導(dǎo)的m6A修飾在幾種癌癥中的作用已被闡明，但其在結(jié)直腸癌中發(fā)揮功能的具體機制仍不清楚。
2023年11月，山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院張松研究團(tuán)隊在Cell Death & Disease (IF 9.0)上發(fā)表“METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway”文章。研究揭示了METTL3具有作為m6A“寫入器”和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的雙重作用，通過m6A/YTHDF1軸上調(diào)JAK1的表達(dá)，同時協(xié)同NF-κB增強STAT3轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致STAT3信號通路激活和結(jié)直腸癌進(jìn)展。
研究結(jié)果與方法
1、METTL3在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮促癌作用
采用蛋白質(zhì)印跡、免疫組化染色并結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中m6A和METTL3的表達(dá)均上調(diào)。為了進(jìn)一步闡明METTL3介導(dǎo)的m6A靶向基因調(diào)控的機制，使用慢病毒介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染建立了METTL3穩(wěn)定降低的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和LoVo細(xì)胞。集落形成、MTT測定以及Transwell分析顯示，METTL3敲低顯著抑制了癌細(xì)胞的增殖及遷移，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)多數(shù)METTL3沉默的細(xì)胞其周期停滯在G1/G0期，但細(xì)胞凋亡沒有發(fā)生明顯變化。因此，METTL3可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和遷移來發(fā)揮促癌作用，但不依賴于細(xì)胞凋亡控制。
圖1. METTL3在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的促癌作用
2、METTL3沉默對JAK1/STAT3信號通路的影響
斑點雜交結(jié)果顯示METTL3沉默的癌癥細(xì)胞中RNA m6A水平顯著降低，隨后對METTL3缺失或?qū)φ誋CT116細(xì)胞進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀和RNA測序（MeRIP-seq），途徑富集統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)JAK/STAT信號通路表達(dá)差異顯著。WB結(jié)果表明METTL3沉默顯著抑制了STAT3的磷酸化，并明顯降低JAK1和STAT3的表達(dá)。研究人員利用攜帶CRISPR/Cas9系統(tǒng)的慢病毒載體構(gòu)建了METTL3敲除的HCT116細(xì)胞（KO-C4、KO-C7），實時PCR研究發(fā)現(xiàn)，METTL3基因敲除在mRNA水平上顯著下調(diào)STAT3的表達(dá)，但對JAK1 mRNA的表達(dá)沒有影響；外源性過表達(dá)野生型METTL3（WT-METTL3）和突變體METTL3 (D395A/W398A)，發(fā)現(xiàn)野生型或突變型METTL3過表達(dá)均挽救了STAT3的表達(dá)，但只有WT-METTL3挽救了JAK1的表達(dá)，而突變型METTL3過表達(dá)未能挽救JAK1的表達(dá)。上述數(shù)據(jù)表明，METTL3以m6A依賴的方式在蛋白質(zhì)水平而不是mRNA水平上調(diào)節(jié)JAK1的表達(dá)，并影響STAT3 mRNA的表達(dá)，這共同促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞JAK1/STAT3信號通路的激活。
圖2. METTL3沉默對JAK1/STAT3信號通路的影響
3、YTHDF1以m6A依賴的方式促進(jìn)JAK1 mRNA翻譯
大量證據(jù)表明，YTHDF1能夠通過識別靶RNA的m6A 位點促進(jìn)其翻譯。研究者利用慢病毒載體構(gòu)建了YTHDF1沉默的HCT116細(xì)胞系，蛋白質(zhì)印跡研究顯示，YTHDF1敲低可有效抑制STAT3磷酸化，并降低JAK1的表達(dá)水平，但對STAT3的表達(dá)沒有影響。RIP和定量實時PCR分析發(fā)現(xiàn)JAK1 mRNA在YTHDF1免疫沉淀物中富集，并且在METTL3敲除后，這種相互作用明顯減弱，表明m6A在YTHDF1和JAK1 mRNA的相互作用中具有不可或缺性。此外，YTHDF1的沉默顯著抑制了細(xì)胞增殖、遷移，上述數(shù)據(jù)表明，METTL3依賴YTHDF1與JAK1 m6A位點的結(jié)合能力來促進(jìn)JAK1翻譯，導(dǎo)致STAT3途徑激活和癌癥進(jìn)展。
進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)METTL3和NF-κB協(xié)同促進(jìn)STAT3的轉(zhuǎn)錄，STAT3信號通路在METTL3介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移中起著重要作用。
圖3. YTHDF1以m6A依賴的方式促進(jìn)JAK1 mRNA的翻譯
4、METTL3和YTHDF1在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移
最后，為了探討METTL3在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的作用，將METTL3缺失或非缺失的結(jié)直腸癌細(xì)胞皮下注射到BALB/c裸鼠中，結(jié)果顯示METTL3的敲除有效地延緩了腫瘤生長。利用肺轉(zhuǎn)移小鼠模型檢測發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射METTL3非缺失的HCT116對照細(xì)胞導(dǎo)致嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移，而METTL3的缺失幾乎完全消除了轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的形成。進(jìn)一步將YTHDF1缺失的癌癥細(xì)胞注射到裸鼠中，以建立荷瘤和肺轉(zhuǎn)移小鼠模型，YTHDF1沉默后，腫瘤負(fù)荷明顯減輕，肺組織中的轉(zhuǎn)移結(jié)更少。此外，在METTL3或YTHDF1缺失的異種移植物中，STAT3信號相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均降低。上述研究結(jié)果表明，METTL3以m6A依賴性和非依賴性的方式同時上調(diào)JAK1和STAT3的表達(dá)，這有助于STAT3信號激活，導(dǎo)致癌癥在體外和體內(nèi)的增殖和進(jìn)展。
圖4. METTL3和YTHDF1在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移
小結(jié)
本研究表明METTL3通過以m6A依賴性和非依賴性的方式上調(diào)JAK1和STAT3的表達(dá)，有助于p-STAT3信號通路的激活并促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。因此，同時抑制p-STAT3和METTL3可能為結(jié)直腸癌治療開辟新的前景。
