武漢大學人民醫(yī)院文重遠/李俊峰研究團隊揭示DNER在胰島素信號調(diào)節(jié)肝糖異生中的關鍵作用
肝胰島素抵抗導致肝糖異生增加，是2型糖尿?。═2DM）空腹高血糖的主要原因，然而其潛在的信號機制仍有待探索。Delta/Notch樣表皮生長因子（EGF）相關受體（DNER）最初被描述為神經(jīng)元特異性Notch配體，最近被確定為T2DM的易感基因，暗示DNER在胰島素信號通路中有潛在的作用。2024年3月27日，武漢大學人民醫(yī)院文重遠/李俊峰研究團隊在Molecular Metabolism (IF 8.1)期刊發(fā)表題為“Tyrosine-phosphorylated DNER sensitizes insulin signaling in hepatic gluconeogenesis by inducing proteasomal degradation of TRB3”的文章。研究發(fā)現(xiàn)DNER通過泛素-蛋白酶體降解途徑抑制內(nèi)源性Akt抑制劑TRB3，從而增強肝糖異生中的胰島素信號傳導，揭示了DNER在肝糖異生中的作用及其胰島素增敏作用。
研究方法與結果
1、體內(nèi)外敲低DNER降低胰島素誘導的Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK信號通路的激活
與C57BL/6J小鼠相比，ob/ob和db/db小鼠的胰島素靶組織中（肝臟、骨骼肌及內(nèi)臟脂肪組織）DNER和磷酸化Akt下調(diào)，而TRB3上調(diào)，表明DNER蛋白水平與Akt磷酸化呈正相關，而TRB3蛋白水平與Akt磷酸化呈負相關，并且在胰島素抵抗狀態(tài)下，DNER表達和Akt激活下調(diào)，而TRB3表達上調(diào)。
為研究DNER調(diào)節(jié)肝糖異生的具體作用，一方面作者使用腺病毒干擾載體在AML-12細胞中敲低DNER蛋白，結果顯示DNER表達的敲低減弱了Akt的磷酸化，從而降低了FoxO1的磷酸化水平，導致在基礎和胰島素刺激條件下糖異生基因（G6Pase和PEPCK）表達增加。DNER敲低過程中的這些變化伴隨著2DG攝取減少、葡萄糖產(chǎn)量增加和GSK3a/b磷酸化減少。此外，DNER表達減少不影響TRB3基因表達，但增加了TRB3蛋白表達，表明DNER可能調(diào)節(jié)TRB3蛋白的穩(wěn)定性。另一方面，作者將Ad-shDNER注射小鼠體內(nèi)，以降低小鼠肝細胞中DNER的表達，葡萄糖和丙酮酸鹽耐受性測試顯示，敲低組小鼠葡萄糖耐受性顯著受損，且丙酮酸-葡萄糖轉化過度。與AML12肝細胞中的觀察結果一致，體內(nèi)DNER敲低同樣伴隨著TRB3蛋白表達的增加，Akt及其兩個下游靶標GSK3a/b和FoxO1的磷酸化減弱，導致G6Pase和PEPCK的基因和蛋白水平增加。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DNER對肝胰島素信號傳導的增強作用與Notch1和Girdin無關。
體內(nèi)外敲低DNER降低胰島素誘導的Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK信號通路的激活
2、DNER通過TRB3-Akt信號通路負調(diào)控肝糖異生
為了闡明DNER是否通過TRB3-Akt信號通路負調(diào)節(jié)肝糖異生，作者進行了蛋白質印跡分析。DNER的過表達顯著增強了胰島素刺激的Akt及其兩個下游信號分子FoxO1和GSK3a/b的磷酸化，從而導致G6Pase和PEPCK的表達減少和葡萄糖產(chǎn)生減少；相反，DNER的敲低減弱了胰島素刺激的Akt-FoxO1/GSK3a/b磷酸化，增加了G6Pase和PEPCK的表達，并促進了葡萄糖的產(chǎn)生。此外，DNER過表達或敲低誘導的肝臟糖異生中胰島素信號通路的改善或受損可分別通過TRB3過表達或敲低得到挽救，這些結果表明，TRB3是DNER介導的Akt磷酸化和肝糖異生基因表達所必需的。
接下來，使用蛋白質印跡分析和qPCR研究了Akt在介導DNER對肝糖異生作用中的作用，發(fā)現(xiàn)DNER的過表達增強了胰島素刺激的Akt激活和糖異生基因表達的抑制，使用wortmannin（Akt上游分子PI3K的抑制劑）處理，顯著降低了DNER過表達對肝胰島素信號傳導的增強作用，相反，Akt磷酸化激活劑SC79則挽救了DNER敲低誘導的肝糖異生中受損的胰島素信號傳導。上述結果表明DNER通過TRB3-Akt依賴性途徑負調(diào)控肝臟糖異生。
DNER對糖異生的抑制作用依賴于TRB3-Akt
3、DNER與胰島素受體物理相互作用，并在Tyr677處磷酸化響應胰島素刺激
為了研究DNER是否通過與胰島素受體的物理相互作用增強胰島素信號傳導，作者進行了Co-IP實驗，結果表明在基礎和胰島素刺激的條件下，DNER和胰島素受體之間存在相互作用，胰島素處理顯著刺激DNER在酪氨酸的磷酸化，并且Tyr677是潛在的磷酸化位點。為了確定Tyr677磷酸化在DNER介導胰島素增敏中的作用，作者在AML-12肝細胞中過表達HA標記的野生型和突變體（Tyr677-To-Ala）DNER。DNER突變和敲低都不影響TRB3的基因表達水平，進一步證實DNER在蛋白質水平而不是基因水平上調(diào)節(jié)TRB3。將DNER的Tyr677突變?yōu)锳la大大削弱了胰島素刺激的DNER磷酸化，同時減弱了DNER誘導的TRB3降解，此外DNER對胰島素刺激的Akt激活和糖異生基因（G6Pase和PEPCK）表達的抑制作用也顯著降低，并伴隨著FoxO1和GSK3a/b的磷酸化減少，2-DG攝取減少和葡萄糖產(chǎn)生增加。這些結果表明，Tyr677的磷酸化在糖異生中增強肝胰島素信號傳導起著關鍵作用。
Tyr677磷酸化是DNER促進胰島素信號傳導的必要條件
小結
本研究揭示了DNER在增強胰島素刺激的Akt激活和抑制肝細胞糖異生中的新作用，證明了胰島素刺激的DNER Tyr677磷酸化在誘導TRB3的蛋白酶體降解和通過Akt-FoxO1-G6Pase/PEPCK途徑抑制肝糖異生中起著關鍵作用。胰島素刺激Tyr677磷酸化的發(fā)現(xiàn)也揭示了DNER和胰島素信號通路之間相互作用的機制。
當前位置：首頁 > 新聞中心 > 新聞資訊
