Advanced Science(IF14.3)｜浙大羅沛華教授研究團(tuán)隊(duì)揭示克唑替尼肝毒性的關(guān)聯(lián)機(jī)制及干預(yù)策略
克唑替尼作為治療ALK陽性非小細(xì)胞肺癌的一線藥物，臨床試驗(yàn)顯示超半數(shù)患者出現(xiàn)肝毒性，但機(jī)制不明。膽固醇代謝異常可能與克唑替尼肝毒性有關(guān)，角鯊烯環(huán)氧酶（SQLE）作為膽固醇合成關(guān)鍵酶，其在該過程中的作用有待探究。近期，浙江大學(xué)羅沛華教授研究團(tuán)隊(duì)在Advanced Science(IF14.3)期刊發(fā)文“Disturbing Cholesterol/Sphingolipid Metabolism by Squalene Epoxidase Arises Crizotinib Hepatotoxicity”。研究發(fā)現(xiàn)克唑替尼通過抑制自噬體-溶酶體融合，使角鯊烯環(huán)氧酶（SQLE）積累，引發(fā)膽固醇和鞘脂代謝紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，為克唑替尼肝毒性的防治提供了新方向。
AAV8-TBG-Sqle shRNA顯著抑制SQLE的表達(dá)
Ad-mCherry-GFP-LC3B感染肝細(xì)胞監(jiān)測自噬通量
部分研究結(jié)果分享
1.克唑替尼誘導(dǎo)異常代謝、細(xì)胞凋亡和自噬
臨床試驗(yàn)表明克唑替尼治療患者會(huì)出現(xiàn)廣泛且嚴(yán)重的肝毒性。對克唑替尼處理的人肝細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，分析顯示，與代謝、凋亡和自噬途徑相關(guān)的蛋白表達(dá)以及膽固醇生物合成過程有明顯變化。使用克唑替尼處理C57BL/6J小鼠及永生化人肝細(xì)胞系HL-7702，發(fā)現(xiàn)克唑替尼可以誘導(dǎo)代謝異常，表現(xiàn)為肝損傷相關(guān)的血清生物標(biāo)志物增加及脂質(zhì)積累。同時(shí)，克唑替尼還誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制自噬，用Ad-mCherry-GFP-LC3 病毒感染肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，克唑替尼處理后自噬體數(shù)量明顯增加，表明自噬后期受阻；多種肝癌細(xì)胞系中 LC3-II 蛋白水平明顯增加，證實(shí)自噬體-溶酶體融合被阻斷，而激活自噬的二甲雙胍能夠恢復(fù)被克唑替尼阻斷的自噬流。綜上所述，克唑替尼可以在膽固醇代謝、凋亡和自噬抑制方面引起異常效應(yīng)。
克唑替尼誘導(dǎo)異常代謝、細(xì)胞凋亡和自噬
2.下調(diào)SQLE可緩解克唑替尼誘導(dǎo)的肝毒性
進(jìn)一步的篩選分析發(fā)現(xiàn)SQLE的異常積累是導(dǎo)致克唑替尼肝毒性的重要因素。使用AAV8-TBG-Sqle shRNA 抑制小鼠體內(nèi)SQLE的表達(dá)，隨后給予克唑替尼處理。結(jié)果顯示抑制SQLE能有效緩解克唑替尼誘導(dǎo)的肝毒性和代謝異常。選擇二甲雙胍作為自噬激活劑處理小鼠，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可顯著緩解克唑替尼誘導(dǎo)的自噬體-溶酶體融合抑制，降低SQLE和c-PARP的表達(dá)水平，使其恢復(fù)至正常范圍。同時(shí)，二甲雙胍能夠顯著逆轉(zhuǎn)克唑替尼誘導(dǎo)的ALT和AST升高，以及肝臟TC和TG水平的上升。這表明通過激活自噬來下調(diào)SQLE水平，可有效治療克唑替尼誘導(dǎo)的肝損傷和代謝異常。隨后的代謝組學(xué)等分析揭示了SQLE的過度積累可能會(huì)導(dǎo)致代謝物的廣泛波動(dòng)，值得注意的是，膽固醇的局部積累會(huì)影響神經(jīng)酰胺和鞘氨醇的代謝，從而將死亡信號傳遞給下游的凋亡效應(yīng)器。
下調(diào)SQLE可減輕克唑替尼引起的肝毒性
3.SQLE酶抑制劑特比萘芬干預(yù)克唑替尼的肝毒性
構(gòu)建SQLE活性缺失質(zhì)粒（SQLE-Y195F-Flag）轉(zhuǎn)染HL-7702細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型SQLE質(zhì)粒會(huì)增加cPARP表達(dá)，而轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒不影響，表明干預(yù)SQLE酶活性可能是減輕肝毒性的潛在策略。引入特比萘芬并與克唑替尼聯(lián)合處理細(xì)胞，結(jié)果顯示特比萘芬有效抑制了克唑替尼引起的c-PARP上調(diào)，且不影響SQLE蛋白水平，初步表明特比萘芬可干預(yù)克唑替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步體內(nèi)驗(yàn)證，用克唑替尼和/或特比萘芬處理C57BL/6J小鼠6周，分析c-PARP表達(dá)和進(jìn)行TUNEL檢測，發(fā)現(xiàn)特比萘芬顯著抑制克唑替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，明顯減輕克唑替尼導(dǎo)致的肝臟炎癥細(xì)胞大量浸潤和脂質(zhì)滴積累；此外，特比萘芬改善了由克唑替尼引起的肝臟異常代謝過程。這些數(shù)據(jù)證明，SQLE酶活性抑制劑特比萘芬在治療克唑替尼誘導(dǎo)的肝毒性方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
SQLE酶抑制劑特比萘芬干擾克唑替尼的肝毒性
研究結(jié)論
本研究揭示了克唑替尼肝毒性主要由膽固醇代謝異常、細(xì)胞凋亡和自噬阻斷引起，SQLE積累起關(guān)鍵作用。二甲雙胍和特比萘芬可改善肝毒性，為臨床安全用藥提供策略，也為相關(guān)疾病治療提供了新思路。
