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“獨家秘笈”｜蛋白磷酸化攻略大全

前幾日，我們?yōu)榇蠹医榻B了關(guān)于反相蛋白微陣列RPPA的有關(guān)知識（『癌癥相關(guān)蛋白及磷酸化水平大數(shù)據(jù)等你來分析！），利用RPPA技術(shù)可以同時分析成百上千種細(xì)胞或者組織樣本中不同蛋白的表達情況，包含修飾后蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰基化）的差異表達比對分析，那么，關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾你了解多少呢，蛋白質(zhì)磷酸化究竟又是怎么一回事？今天，小V就和大家一起來探索有關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化的那些事兒！

蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，功能更完善，調(diào)節(jié)更精細(xì)，作用更專一。蛋白翻譯后修飾包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羥基化、脂?；Ⅳ然裙矁r修飾。其中，蛋白磷酸化是最常見和最重要的翻譯后修飾之一，它在每個生物的各個方面都扮演著重要的角色，例如基因轉(zhuǎn)錄、表達、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生等。

01 蛋白磷酸化簡介

蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，將ATP γ位的磷酸基團，轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈上的過程。該過程是可逆的，催化蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化的酶被稱為蛋白激酶（protein kinase, PK），而催化蛋白質(zhì)去磷酸化的酶被稱為蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）（圖1）。蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性和功能的重要機制。

圖1：蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化的過程（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）

02 蛋白磷酸化分類及位點

蛋白磷酸化是生物體內(nèi)普遍存在的一種調(diào)節(jié)方式。據(jù)報道，人類基因組編碼的21000個蛋白質(zhì)中，90%以上發(fā)生了磷酸化。根據(jù)被磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白質(zhì)磷酸化可分為 4 大類，具體分類和磷酸化位點見表1，磷酸化的9個氨基酸分子式見圖2。超過三分之一的蛋白磷酸化發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上：其中絲氨酸殘基最多（86.4%），其次是蘇氨酸殘基（11.8%），酪氨酸殘基最少（1.8%）。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化組成了O-磷酸化。O-磷酸化在酸性條件下非常穩(wěn)定，因此在細(xì)胞生物學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中研究廣泛。而N-磷酸化由于不穩(wěn)定導(dǎo)致其檢測極具挑戰(zhàn)性。加之，催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的缺乏進一步限制了它的研究。其他兩類磷酸化（S-磷酸化和?；姿峄┑难芯繄蟮绤s少之又少。

表1：蛋白磷酸化類型及位點

圖2：磷酸化的9個氨基酸分子式 （B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）

03 蛋白磷酸化相關(guān)酶

人類基因組中約有500多種激酶和200多種磷酸酶能調(diào)控蛋白的磷酸化過程，這使得蛋白磷酸化更為復(fù)雜，這些磷酸化相關(guān)酶在精細(xì)調(diào)控生物體的眾多細(xì)胞過程中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。

04 蛋白磷酸化的檢測方法

蛋白質(zhì)磷酸化的分析和磷酸化位點的鑒定已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)注點之一。目前蛋白質(zhì)磷酸化的檢測方法主要有特異性抗體（如western blot）、p32放射性標(biāo)記、質(zhì)譜、化學(xué)生物相結(jié)合、核磁共振等。每種方法有其各自的優(yōu)缺點（表2），研究人員可根據(jù)實驗設(shè)計挑選合適的檢測方法。

表2：蛋白質(zhì)磷酸化檢測方法的比較 （B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）

05 定點突變在蛋白磷酸化研究中的作用

定點突變可以隨心所欲地改變已知DNA序列中的堿基。在基礎(chǔ)研究中，科研工作者通常需要通過改變DNA序列獲得突變基因，以研究基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；或者通過改變氨基酸序列獲得突變蛋白，以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，從微觀水平闡明生理狀態(tài)下基因的調(diào)控機理、疾病的病因和發(fā)病機制。在磷酸化蛋白的研究中，構(gòu)建模擬磷酸化和非磷酸化的突變實驗是研究磷酸化功能效應(yīng)的一種常用方法。

一、磷酸化位點的查找

磷酸化定點突變實驗的第一步首先要查找磷酸化位點。我們以常用的蛋白數(shù)據(jù)庫UniProt為例說明，具體步驟如下：

（1）通過https://www.uniprot.org/鏈接進入UniProt官網(wǎng)，進入如下主界面：

（2）以人源p53蛋白為例，在Search欄（見上圖紅色標(biāo)記位置）中輸入p53，進入如下界面：

（3）點擊人源p53蛋白在數(shù)據(jù)庫中的編號“Q04637”（上圖紅色箭頭所示），查看專家注釋。這里重點介紹“PTM/Processing”。點擊下圖左邊紅色箭頭指向的“PTM/Processing”欄查看分子加工、氨基酸修飾、翻譯后修飾、蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫、翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫和參考文獻。

（4）假如我們對15位的磷酸化位點修飾，點擊紅色圈中的15即可查看對應(yīng)的氨基酸序列（見下圖，黃色標(biāo)記的“S”）。

（5）接下來，我們返回上一頁面，點擊數(shù)據(jù)庫中的“Names & Taxonomy”選項查找該基因的mRNA序列，點擊藍(lán)色標(biāo)記的基因名即可查閱該基因的詳細(xì)信息。

（6）p53的mRNA序列查找可點擊黃色箭頭處獲取：

二、表征磷酸化修飾的定點突變

1）表征磷酸化修飾的突變氨基酸

通過第2部分磷酸化類型的介紹，我們知道Ser、Thr和Tyr殘基上的磷酸化較常見，特別是Ser。根據(jù)文獻報道，表征這3種磷酸化修飾的定點突變見表3：

表3：表征Ser、Thr和Tyr磷酸化修飾的突變氨基酸

2）表征磷酸化修飾的原理

蛋白質(zhì)的磷酸化導(dǎo)致磷酸基團受體氨基酸殘基上增加了凈負(fù)電荷（pSer，pThr和pTyr帶2個負(fù)電荷【見上述圖2】）。而取代的酸性氨基酸（Glu和Asp）的負(fù)電荷側(cè)鏈在一定程度上模擬了蛋白質(zhì)中磷酸基團的添加，且長度相似。為了使得實驗結(jié)果準(zhǔn)確，除了構(gòu)建模擬磷酸化的突變體外，模擬非磷酸化的點突變構(gòu)建也是必需的，即磷酸基團受體氨基酸殘基被一個不帶電的和不能磷酸化的氨基酸殘基所取代。目前，Ala和Phe已成功模擬非磷酸化。

3）如何選擇表征磷酸化修飾的突變氨基酸？

表征磷酸化修飾的突變氨基酸選擇主要從氨基酸的長度、大小、電荷和結(jié)構(gòu)方面選擇。例如，與磷酸化的氨基酸殘基相比，Glu或Asp除了帶1個負(fù)電荷外，還可能占據(jù)更小或不同的空間。因此，在許多情況下，Glu可能比更小的Ala能更好地模擬pSer。但是，注意不是所有情況，這2種氨基酸均已成功模擬pSer。再比如，對于非磷酸化的模擬，Ala經(jīng)常被作為取代的氨基酸殘基。但是，對于非磷酸化的Tyr，Phe可能是一個更好的的選擇。

06 應(yīng)用實例

實例一 蛋白磷酸化與肝自噬

2018年10月，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉教授課題組在Molecular Cell(IF=15.584)雜志發(fā)表了題為“mTORC1-Regulated and HUWE1-Mediated WIPI2 Degradation Controls Autophagy Flux”研究論文，該論文從采用質(zhì)譜確定WIPI2新的互作蛋白出發(fā)，經(jīng)體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)mTORC1 & WIPI2 &HUWE1三者之間的調(diào)控關(guān)系、功能效應(yīng)、生物效應(yīng)和生理功能：WIPI2是mTORC1新的磷酸化底物。mTORC1通過磷酸化WIPI2，促進WIPI2與其E3泛素連接酶HUWE1的相互作用，導(dǎo)致WIPI2的泛素化和經(jīng)蛋白酶體的降解，最終抑制自噬，調(diào)控模型示意圖見圖3。

圖3：mTORC1 & WIPI2 &HUWE1在細(xì)胞自噬中的調(diào)控示意圖

在這里，我們重點展示作者體內(nèi)生理功能的科研成果，這部分研究涉及到模擬磷酸化和非磷酸化突變體的構(gòu)建，而且非常榮幸的是，本部分研究所用AAV產(chǎn)品由維真生物助力。首先，作者饑餓處理小鼠12h&24h，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)肝臟中的WIPI2蛋白量增加，而磷酸化的WIPI2卻減少。為了獲得WIPI2磷酸化調(diào)控小鼠肝自噬的直接證據(jù)，作者使用rAAV-WIPI2, rAAV-WIPI2-S395A, or rAAV-WIPI2-S395D腹腔注射小鼠，4周后發(fā)現(xiàn)WIPI2-S395A蛋白量增加，而WIPI2-S395D卻減少；而且，與WT-WIPI2相比，WIPI2-S395A而不是WIPI2-S395D明顯降低了P62和NBR1的蛋白量。此外，腹腔注射rAAV-shHUWE1的小鼠LC3 puncta、WIPI2的蛋白量和P62&NRB1的降解均表現(xiàn)出了增加（圖4）。

圖4：mTORC1介導(dǎo)的WIPI2磷酸化在小鼠肝臟中調(diào)控細(xì)胞自噬

實例二 蛋白磷酸化與細(xì)胞遷移、增值和分化

幾乎在同一時間，香港浸會大學(xué)的張老師課題組在Cell Death Discov(IF=4.114)雜志發(fā)表了題為“Oleanolic acid enhances neural stem cell migration, proliferation, and differentiation in vitro by inhibiting GSK3βactivity”研究論文，揭示了齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、增殖和分化，此項工作成果對于治療神經(jīng)退行性疾病具有重要的意義。

首先，作者通過神經(jīng)球形成實驗證明OA增加NSCs的遷移；通過CCK-8實驗和神經(jīng)球形成實驗證實了OA促進NSCs的增殖；通過western blot和免疫熒光實驗揭示了OA促進NSCs分化為神經(jīng)元。接著，作者通過分子對接表明GSK3β是OA作用的直接靶基因。最后，作者通過western blot和構(gòu)建非磷酸化突變體（維真生物助力腺病毒）揭示了本論文主題，實驗結(jié)果見圖5。

圖5：齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化
[ 注：Nestin (NSCs marker)；MAP2 (microtubule-associated protein-2, neuron marker)；GFAP(astrocytes marker)]

維真生物助力蛋白質(zhì)磷酸化研究

維真生物已建成了18000余種人源基因的現(xiàn)貨克隆庫與12000余種人源基因的腺病毒庫，并有蛋白激酶與磷酸酶的克隆子庫，可為您提供蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)基因的克隆與腺病毒；我們還建成了靶向13000余種小鼠基因的gRNA pool 克隆庫，同樣地，我們也有蛋白磷酸化相關(guān)基因的gRNA pool克隆子庫，您可直接包裝AAV，搭配spCas9的轉(zhuǎn)基因小鼠，完成基因在體內(nèi)的精準(zhǔn)調(diào)控，所以如果您有基因喪失方向的實驗需求，這款產(chǎn)品將是您的理想選擇！此外，我們還有靶向700余種人源激酶的gRNA慢病毒文庫，配合CAS9慢病毒或CAS9穩(wěn)定細(xì)胞系，可實現(xiàn)快速高通量地篩選。不僅如此，我們還可以根據(jù)您的實驗需求進行磷酸化相關(guān)基因的定點突變，并為您提供下游的病毒包裝和基因檢測服務(wù)等。

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