客戶文章分享 ‖ Id2有效促進小鼠坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生
Id2有效促進小鼠坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生
周圍神經(jīng)損傷 是臨床常見多發(fā)疾病，可由外傷、感染、壓迫、缺血、腫瘤和營養(yǎng)代謝障礙等多種原因引起。周圍神經(jīng)損傷后，軸突再生速度減慢，在長期的慢性去神經(jīng)支配期間，肌肉纖維逐漸萎縮和退化，導(dǎo)致神經(jīng)肌肉功能不可逆喪失。因此，加快神經(jīng)軸突的再生速度，縮短神經(jīng)再支配的時間，可能是改善周圍神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)和防止實質(zhì)性肌肉萎縮發(fā)生的有效途徑。
DNA結(jié)合抑制劑2 (Inhibitor of DNA binding 2, Id2)作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子的負調(diào)控因子，可抑制細胞分化，促進細胞增殖，已有研究表明，Id2能促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的軸突再生，然而是否可以促進周圍神經(jīng)損傷后軸突再生和功能恢復(fù)，尚不清楚。
新近研究發(fā)現(xiàn)，Id2同樣可以促進周圍神經(jīng)損傷后軸突再生和損傷神經(jīng)的功能恢復(fù)。過表達Id2（AAV9，立體定位注射脊髓腹角，維真生物提供 ）促進了坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生以及神經(jīng)肌肉接頭的再神經(jīng)化，改善了損傷神經(jīng)的功能。
1. 坐骨神經(jīng)擠壓模型的建立
首先，研究者建立了坐骨神經(jīng)擠壓模型。從圖2可以看出坐骨神經(jīng)損傷后GFP+ 軸突完全損壞，而神經(jīng)外膜仍保持連續(xù)性。通過電生理實驗也發(fā)現(xiàn)刺激坐骨神經(jīng)后誘發(fā)的復(fù)合肌肉動作電位在坐骨神經(jīng)損傷后1天消失，證實坐骨神經(jīng)擠壓模型構(gòu)建成功。
圖2. AAV9表達鑒定與坐骨神經(jīng)損傷模型建立
2. AAV9病毒的脊髓內(nèi)注射及表達鑒定
將成年雌性C57BL/6小鼠麻醉后，進行椎板切除術(shù)暴露脊髓，將滴度為 6×10E12vg/mL的AAV9-Id2-3×Flag-GFP和AAV9-GFP 分別通過 立體定向注射至脊髓雙腹側(cè)角。每只小鼠注射四個部位（左右腹角各兩個），每個部位注射0.5 μL的病毒量
病毒注射2周后，Id2實驗組和GFP對照組均可見ChAT+ 運動神經(jīng)元與GFP的共標記（圖3A ,B）?？笷lag抗體染色實驗也證實了Id2-Flag融合蛋白在感染神經(jīng)元中的成功表達（圖3C）。從整體感染效率來看，Id2實驗組和GFP對照組相當，注射中心有80%以上的ChAT+ 運動神經(jīng)元被成功感染（圖3D）。而且，投射到坐骨神經(jīng)的軸突也被GFP所標記（圖3E），可以評估損傷后坐骨神經(jīng)的再生情況。
圖3. AAV9成功感染脊髓運動神經(jīng)元
3. 過表達Id2加速坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生
接下來，研究者分別對距離受損部位不同位置處的從腰脊髓運動神經(jīng)元中投射出的GFP+ 軸突的數(shù)量進行了量化，以此評估坐骨神經(jīng)損傷后的軸突再生情況。由于周圍神經(jīng)仍具有較強的再生能力，因此可以看到，GFP組和Id2組在坐骨神經(jīng)損傷后2周均有大量GFP+ 軸突延伸到損傷部位之外。通過觀察，研究者發(fā)現(xiàn)兩組在1mm和2mm處的GFP+ 軸軸突數(shù)量相當，并無顯著差異。然而，在距離受損部位3mm以上的位置處，Id2組GFP+ 軸軸突數(shù)量明顯多于GFP組。此外，在距離受損部位超過9mm時，Id2組軸突再生的數(shù)量約為60%，而GFP組卻不足30%（圖4）。腓腸肌受坐骨神經(jīng)下行的脛神經(jīng)支配，如圖5所示，在坐骨神經(jīng)受損后兩周，GFP組腓腸肌內(nèi)只可見少量GFP+ 軸神經(jīng)纖維，而Id2組GFP+ 軸神經(jīng)纖維數(shù)量出現(xiàn)明顯增加。以上結(jié)果說明，Id2能夠促進坐骨神經(jīng)損傷后的軸突再生。
圖4. Id2促進坐骨神經(jīng)擠壓后軸突的再生
圖5. Id2加速再生軸突延伸至腓腸肌
4. Id2促進坐骨神經(jīng)損傷后NMJ的再神經(jīng)化
為了進一步研究Id2在神經(jīng)修復(fù)中的促進作用，研究者用α-銀環(huán)蛇神經(jīng)毒素標記腓腸肌運動終板檢測了神經(jīng)-肌肉接頭(NMJ)處的再神經(jīng)化。早在坐骨神經(jīng)受損后2周，在Id2組就觀察到腓腸肌內(nèi)少數(shù)終板被GFP+ 運動軸突末端重新支配，而在對照組中未觀察到。坐骨神經(jīng)受損1個月后，GFP組和Id2組均發(fā)生了廣泛地神經(jīng)肌肉再支配。然而，在Id2組中，被GFP+ 運動軸突重新支配的NMJs的總數(shù)明顯更多。這表明，Id2促進了坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)-肌肉接頭處的再神經(jīng)化（圖6）。
圖6. Id2促進了SNI后NMJs處的再神經(jīng)化
5. Id2促進坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)
在坐骨神經(jīng)受損后1個月，研究者對神經(jīng)傳導(dǎo)和運動功能的恢復(fù)情況進行了評估。通過記錄腓腸肌的復(fù)合肌肉動作電位，發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)受損后，復(fù)合肌肉動作電位會出現(xiàn)波幅降低，潛伏期延長，與GFP組相比，注射Id2組的復(fù)合肌肉動作電位振幅明顯升高，潛伏期縮短，這表明Id2的過表達有效恢復(fù)了神經(jīng)肌肉的傳導(dǎo)功能（圖7）。
圖7. Id2增強了SNI后神經(jīng)傳導(dǎo)和神經(jīng)肌肉傳遞的恢復(fù)
CatWalk步態(tài)分析系統(tǒng)是一種評估小鼠坐骨神經(jīng)損傷后運動損傷和恢復(fù)的重要工具，文章最后，研究者利用這一系統(tǒng)在小鼠坐骨神經(jīng)受損前和損傷后一個月分別進行了測試，發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)損傷后，小鼠的腳印面積和步周長減小，而腳間距離增加。與GFP組相比，Id2過表達的小鼠腳印面積有所增加，腳間距離也恢復(fù)至正常水平。以上數(shù)據(jù)表明，Id2可促進坐骨神經(jīng)損傷后運動功能的恢復(fù)（圖8）。
圖8. Id2改善了SNI后坐骨神經(jīng)運動功能的恢復(fù)
小結(jié)
綜上所述，Id2可促進小鼠坐骨神經(jīng)損傷后的軸突再生，神經(jīng)肌肉再神經(jīng)化以及坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)，因此提升神經(jīng)元中Id2的水平可能為修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供一個很有前途的策略。
