Nat Commun：南方醫(yī)科大學(xué)高天明教授團(tuán)隊(duì)揭示星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的ATP調(diào)控自閉癥的作用機(jī)制

近日，南方醫(yī)科大學(xué)高天明教授帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在Nature Communications（IF=14.919）上發(fā)表了題為“Impaired calcium signaling in astrocytes modulates autism spectrum disorder-like behaviors in mice”的文章，揭示了內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（mPFC）腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的ATP通過P2X2受體調(diào)控小鼠的自閉癥（ASD）樣行為，證實(shí)了ATP在ASD的病理生理過程中發(fā)揮的潛在作用。

維真生物為本研究助力

病毒產(chǎn)品：AAV8-GFAP-hM3Dq-mCherry & AAV9-GfaABC1D-ATP1.0

研究背景

自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorder,ASD）是一種較為嚴(yán)重的廣泛性發(fā)展障礙疾病，常起病于嬰幼兒期，一般有社交障礙、溝通困難、刻板行為和興趣狹隘等癥狀。根據(jù)WHO發(fā)布的報(bào)告，全球每160名兒童中就有1名患自閉癥。然而，截止目前ASD的發(fā)病機(jī)制仍是未解難題。

已有研究表明，在ASD患者和動(dòng)物模型中觀察到了星形膠質(zhì)細(xì)胞的改變，但是星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙與ASD樣表型的因果關(guān)系尚不清楚。已知星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞類型，參與許多重要的腦功能，其激活主要表現(xiàn)為三磷酸肌醇2型受體(IP3R2)介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)鈣信號(hào)的增加。先前研究表明，IP3R2基因突變與ASD相關(guān)，敲除IP3R2后星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙。然而，IP3R2缺陷引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙是否與ASD的發(fā)生有關(guān)尚不清楚。

研究思路

首先，研究者利用IP3R2 KO（IP3R2全身敲除）和IP3R2 cKO小鼠（星形膠質(zhì)細(xì)胞IP3R2特異性敲除）模型，通過雙光子鈣成像、多項(xiàng)自閉癥行為測試及病毒學(xué)手段等發(fā)現(xiàn)IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表現(xiàn)出星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣信號(hào)異常及明顯的社交障礙、重復(fù)刻板等ASD樣癥狀，這說明星形膠質(zhì)細(xì)胞功能異常參與了ASD樣行為。通過微透析、新型ATP探針使用及外源給藥等方法發(fā)現(xiàn)IP3R2突變小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞胞外ATP水平降低，而ATP給藥能夠改善小鼠自閉癥行為，確定了星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放異常與ASD發(fā)生有關(guān)。最后，通過電生理、基因表達(dá)干擾等手段明確了ATP通過P2X2受體調(diào)控GABA能突觸傳遞及ASD樣行為。該研究闡述了星形膠質(zhì)細(xì)胞在ASD樣行為發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的關(guān)鍵作用，并確定了星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的ATP在ASD中的潛在分子角色。

部分研究結(jié)果

1、IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表現(xiàn)出ASD樣行為

首先，研究者制備了IP3R2缺失的IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠模型，通過雙光子顯微鏡成像觀察發(fā)現(xiàn)兩種小鼠體內(nèi)的Ca2+信號(hào)均發(fā)生異常，說明IP3R2的表達(dá)缺失影響了Ca2+的正常釋放。通過對(duì)IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠進(jìn)行自閉癥相關(guān)的行為學(xué)測試（三箱社交偏好實(shí)驗(yàn)、理毛實(shí)驗(yàn)及埋珠實(shí)驗(yàn)），研究者發(fā)現(xiàn)兩種小鼠均表現(xiàn)出明顯的社交障礙和重復(fù)行為，而這兩種癥狀正是自閉癥的核心表型。此外，已知mPFC腦區(qū)是ASD患者功能受損的關(guān)鍵腦區(qū)，在生理和病理?xiàng)l件下與社會(huì)行為密切相關(guān)，研究人員通過RNA干擾技術(shù)特異性敲低mPFC腦區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞的IP3R2，發(fā)現(xiàn)能夠引起小鼠產(chǎn)生明顯的社交障礙。以上結(jié)果表明，mPFC星形膠質(zhì)細(xì)胞中IP3R2的缺失導(dǎo)致了小鼠的ASD樣行為。

2、IP3R2 KO小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中ATP水平降低

接著，研究人員分析了mPFC中星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的遞質(zhì)水平變化，以此研究IP3R2突變小鼠產(chǎn)生自閉癥相關(guān)表型的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。體內(nèi)微透析實(shí)驗(yàn)顯示IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠ATP水平均顯著降低，且IP3R2 KO小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液中ATP濃度也有顯著降低，這說明星形膠質(zhì)細(xì)胞中IP3R2的缺失造成了ATP水平的特異性降低。通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外ATP水平降低，總ATP及胞內(nèi)ATP水平并未發(fā)生變化。作者猜測這可能是由于ATP釋放減少或細(xì)胞外核苷酶降解ATP增加引起。為闡明這一假設(shè)，研究人員在mPFC星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性表達(dá)了AAV8-GFAP::hM3Dq-mcherry和AAV9-GfaABC1D::ATP1.0（維真生物提供），前者用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的特定激活，后者用于星形膠質(zhì)細(xì)胞中ATP釋放的實(shí)時(shí)監(jiān)測。發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比，IP3R2 KO小鼠的ATP釋放明顯降低，說明細(xì)胞外ATP水平的降低可能是由于ATP釋放的降低。通過篩選多種細(xì)胞外ATP酶的mRNA水平及使用ATP酶抑制劑，進(jìn)一步明確了胞外ATP酶活性增強(qiáng)也可能是胞外ATP水平降低的原因。這些數(shù)據(jù)表明，ATP釋放減少和水解增加可能共同降低了IP3R2突變小鼠胞外的ATP水平。

3、ATP給藥可改善IP3R2突變小鼠ASD樣行為

為檢驗(yàn)ATP降低是否與IP3R2突變小鼠的ASD表型有關(guān)，研究者對(duì)IP3R2突變小鼠進(jìn)行ATP的腹腔注射。發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充ATP后IP3R2 KO小鼠和IP3R2 cKO小鼠的社交障礙得到部分緩解，提示IP3R2突變小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP缺乏和社會(huì)損傷之間存在因果聯(lián)系。為了確定mPFC中星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP的減少是否導(dǎo)致IP3R2突變小鼠的社會(huì)功能障礙，研究者在mPFC區(qū)注射ATPγS，得到的結(jié)果與上述結(jié)果一致，這表明mPFC腦區(qū)是IP3R2突變小鼠社交障礙的潛在位點(diǎn)。

4、ATP給藥可恢復(fù)IP3R2突變小鼠受損的GABA能神經(jīng)傳遞

將自閉癥動(dòng)物模型ASD樣行為的可逆性與ASD突觸理論結(jié)合，研究者猜測持續(xù)的突觸病變可能是ASD的潛在原因。為驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者比較了WT與IP3R2 突變鼠mPFC中神經(jīng)元的電生理特性。電生理實(shí)驗(yàn)顯示與WT組小鼠相比，IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠mPFC腦區(qū)錐體神經(jīng)元GABA能輸入減少而谷氨酸能神經(jīng)傳遞不受影響。而GABAAR激動(dòng)劑氯硝西泮的給藥明顯改善了IP3R2 敲除小鼠的社交功能障礙，進(jìn)一步說明GABA能傳遞減弱可能是IP3R2突變小鼠自閉癥樣表型的基礎(chǔ)。為檢測IP3R2突變小鼠GABA能傳遞受損是否是由星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP的減少所引起，研究者測試了ATPγS的拯救作用，發(fā)現(xiàn)注射ATPγS可以逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。結(jié)合以上數(shù)據(jù)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中IP3R2缺失造成的ATP水平降低導(dǎo)致了GABA能突觸功能障礙，可能是ASD樣行為發(fā)生的基礎(chǔ)，通過ATP治療可使其恢復(fù)正?；?。

5、mPFC腦區(qū)P2X2受體介導(dǎo)ATP對(duì)ASD樣行為的調(diào)控

已有研究表明ATP通過P2X2R調(diào)控GABA能突觸傳遞。研究者通過RNA干擾沉默IP3R2 cKO和對(duì)照組小鼠mPFC中的P2X2R，發(fā)現(xiàn)沉默P2X2R，不僅能使WT小鼠表現(xiàn)出明顯的社交障礙，損害GABA能神經(jīng)元傳遞，也阻斷了ATP及ATPγS在治療IP3R2 cKO小鼠自閉癥和增加sIPSC頻率的作用。綜上所述，mPFC中的P2X2受體對(duì)于ATP的抗自閉癥作用是必需的，并通過增強(qiáng)GABA能突觸傳遞介導(dǎo)ATP對(duì)ASD樣行為的調(diào)控。

結(jié)論及意義

該研究首次報(bào)道了星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙與ASD的發(fā)生存在直接聯(lián)系：星形膠質(zhì)細(xì)胞中IP3R2基因的表達(dá)缺失造成胞外ATP水平的下降，進(jìn)而通過P2X2受體調(diào)控GABA能突觸傳遞減弱，導(dǎo)致ASD的發(fā)生。而自閉癥與抑郁癥高度共病，結(jié)合該團(tuán)隊(duì)之前的報(bào)道-星形膠質(zhì)細(xì)胞來源的ATP介導(dǎo)抑郁癥的發(fā)生（Cao et al., Nat Med 2013），可能存在共同的病理生理機(jī)制，這一研究有望為二者的臨床治療提供有效策略。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23843-0