【MS治療新靶點(diǎn)】LRRC4在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的神經(jīng)保護(hù)作用
MS治療新靶點(diǎn)｜LRRC4在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的神經(jīng)保護(hù)作用
多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種慢性神經(jīng)炎性疾病，伴有脊髓脫髓鞘和神經(jīng)退行性病變，多發(fā)于年輕人中。臨床癥狀多種多樣，常見的有肢體無力、感覺異常、視力下降及精神異常等，但MS的病理機(jī)制尚不完全清楚。目前，免疫系統(tǒng)的失調(diào)被廣泛認(rèn)為是MS發(fā)生和發(fā)展的因素。
近期，Molecular Medicine在線發(fā)表了題為“LRRC4 functions as a neuron-protective role in experimental autoimmune encephalomyelitis”的論文，揭示了LRRC4在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，為脊髓疾病機(jī)理研究提供了新的見解，并提出了治療MS的新策略。
研究背景
富含亮氨酸重復(fù)序列4（LRRC4）是LRR蛋白家族的成員，也稱作NGL-2，可以調(diào)節(jié)興奮性突觸的形成，并促進(jìn)神經(jīng)元的軸突分化。已有研究表明，人類LRRC4基因突變與自閉癥譜系障礙（ASD）和智力殘疾有關(guān)，且LRRC4可作為抑癌基因抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞等的增殖，但是在脊髓相關(guān)疾病中LRRC4是否發(fā)揮作用尚不清楚。免疫系統(tǒng)的失調(diào)被廣泛認(rèn)為是MS的啟動(dòng)和發(fā)展的因素，Treg細(xì)胞在MS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化可能是MS診斷和治療的潛在策略，本研究通過建立免疫發(fā)病機(jī)制與MS相似的EAE小鼠模型研究LRRC4對(duì)脊髓相關(guān)疾病的影響。
研究思路
首先，研究者確定了LRRC4主要在脊髓神經(jīng)元中表達(dá)，并利用EAE小鼠模型檢測發(fā)病過程中LRRC4在脊髓中的表達(dá)情況；然后構(gòu)建LRRC4缺失（LRRC4-/-）型小鼠并對(duì)其進(jìn)行EAE誘導(dǎo)，進(jìn)行神經(jīng)功能和體重評(píng)估的同時(shí)使用染色和免疫組織化學(xué)法探究脊髓的病理變化，分析LRRC4對(duì)脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用。接著，研究者通過測定脊髓炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，并利用RNA-seq分析WT與LRRC4-/-小鼠中的差異表達(dá)基因，探究了LRRC4參與EAE發(fā)病的分子機(jī)制；又通過流式細(xì)胞術(shù)檢測脾臟和血液的免疫細(xì)胞因子水平以評(píng)估LRRC4缺失是否對(duì)EAE發(fā)展過程中輔助T細(xì)胞群造成影響，最后研究者使用腺相關(guān)病毒對(duì)LRRC4進(jìn)行過表達(dá)（AAV-LRRC4），觀察AAV-LRRC4異位表達(dá)對(duì)EAE的治療作用。
LRRC4在EAE中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的示意圖
維真生物AAV為本研究助力！
基因
腺相關(guān)病毒產(chǎn)品
注射方式
劑量
富含亮氨酸重復(fù)序列4（LRRC4）
尾靜脈注射
5×1012 vg/kg
部分研究成果分享
1、LRRC4參與EAE的發(fā)展，并具有神經(jīng)保護(hù)作用
首先，研究者使用免疫熒光染色法測定了正常小鼠的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中LRRC4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)LRRC4主要在神經(jīng)元中表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色也證實(shí)了LRRC4在大腦皮層、海馬或脊髓的神經(jīng)元中表達(dá)。接著，研究者使用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG35-55）誘導(dǎo)EAE小鼠并對(duì)脊髓中LRRC4的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)EAE小鼠脊髓中LRRC4 mRNA與蛋白表達(dá)量均降低，但在大腦中未檢測到差異，提示MOG35-55誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元LRRC4表達(dá)下調(diào)，并參與了EAE小鼠的發(fā)病過程。
圖1.LRRC4在EAE鼠脊髓中表達(dá)下調(diào)
考慮到MOG35-55是由于脫髓鞘而誘發(fā)EAE，因此研究者猜測在EAE進(jìn)程中LRRC4是否在脊髓發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。通過構(gòu)建LRRC4缺失（LRRC4-/-）小鼠，并對(duì)其以及WT小鼠進(jìn)行EAE誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)LRRC4的缺失加重了脊髓的損傷程度和脊髓脫髓鞘，淋巴細(xì)胞加速向脫髓鞘病變部位募集。以上結(jié)果表明，LRRC4在EAE過程中起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。
圖2.LRRC4缺失加劇EAE發(fā)展進(jìn)程
2、LRRC4通過Rab7b介導(dǎo)NF-κB的表達(dá)，調(diào)節(jié)EAE的進(jìn)程
鑒于EAE誘導(dǎo)的LRRC4-/-小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞濃度較高，因此推測LRRC4-/-小鼠脊髓中促炎因子的水平要高于正常小鼠，為驗(yàn)證這一猜想研究者測定了各種細(xì)胞因子的水平，發(fā)現(xiàn)LRRC4缺失導(dǎo)致脊髓炎癥反應(yīng)升高和EAE發(fā)病機(jī)制惡化。接著研究者剖析了潛在的分子機(jī)制，檢測了在炎癥和EAE發(fā)病機(jī)制中作用已得到證實(shí)的NF-κB、ERK/MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子NF-κB, p-AKT和p-ERK1/2在正常和EAE狀態(tài)下LRRC4-/-小鼠和WT小鼠中脊髓中的水平，發(fā)現(xiàn)LRRC4缺失誘導(dǎo)NF-κB的上調(diào)和脊髓炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的改變，提示這可能是EAE加速發(fā)展的原因之一。
圖3.LRRC4缺失上調(diào)EAE小鼠NF-κB的表達(dá)
為進(jìn)一步探究LRRC4參與EAE發(fā)病的分子機(jī)制，研究者應(yīng)用RNA-seq來闡明LRRC4缺失后小鼠脊髓的轉(zhuǎn)錄基因變化并進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）的分析。發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGS的KEGG通路與肌萎縮側(cè)索硬化癥有關(guān)，其中小G蛋白R(shí)ab7b上調(diào)非常明顯，且它已被證實(shí)可以激活NF-κB并能促進(jìn)IL-6的產(chǎn)生。通過檢測Rab7b的表達(dá)，研究者發(fā)現(xiàn)LRRC4-/-小鼠中Rab7b的mRNA和蛋白質(zhì)水平均高于WT小鼠，且EAE小鼠脊髓中Rab7b mRNA表達(dá)增強(qiáng)，且與LRRC4呈負(fù)相關(guān)，這增加了Rab7b參與EAE發(fā)病的可能性。
圖4.RNA-seq分析揭示Rab7b在EAE中的作用
為確定LRRC4、Rab7b與NF-κB之間的聯(lián)系，研究者在分離的LRRC4+/+和LRRC4?/?小鼠的神經(jīng)元中檢測了Rab7b和NF-κB p65的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者在LRRC4?/?小鼠神經(jīng)元中表達(dá)上調(diào)，且外源表達(dá)LRRC4后兩者水平均降低。通過RNAi干擾Rab7b后，在LRRC4+/+小鼠神經(jīng)元中表現(xiàn)為NF-κB p65表達(dá)量下降，LRRC4?/?小鼠中未見下降，而當(dāng)Rab7b與LRRC4共轉(zhuǎn)染時(shí)，NF-κB p65表達(dá)顯著降低。這說明，Rab7b能在LRRC4存在的情況下調(diào)節(jié)NF-κB，提示Rab7b可能是LRRC4在NF-κB調(diào)控中的下游效應(yīng)因子。
圖5.Rab7b介導(dǎo)LRRC4?/?神經(jīng)元NF-κB上調(diào)
3、LRRC4缺失導(dǎo)致更嚴(yán)重的Th1免疫反應(yīng)
研究者先前研究已證明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中LRRC4可導(dǎo)致NF-κB活化，并產(chǎn)生IL-6、CCL2和IFN-γ。而IL-6誘導(dǎo)T細(xì)胞分化成Teff細(xì)胞，而非Treg細(xì)胞。EAE小鼠伴有強(qiáng)烈的髓鞘特異性自身免疫反應(yīng)，而LRRC4的缺失導(dǎo)致更嚴(yán)重的髓鞘變性，因此推測LRRC4?/?可能引起更嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。為此研究者對(duì)LRRC4缺失是否會(huì)導(dǎo)致EAE發(fā)展過程中輔助T細(xì)胞群體的改變進(jìn)行了探究。使用流式細(xì)胞儀測定免疫15 d后小鼠的脾臟和血液中細(xì)胞因子的比例，發(fā)現(xiàn)LRRC4缺失未改變正常小鼠脾臟和血液Th1細(xì)胞的比例，但卻增加了EAE小鼠中Th1細(xì)胞的比例。進(jìn)一步對(duì)Treg細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，LRRC4?/?的EAE小鼠脾臟中的Treg細(xì)胞明顯減少，這說明，LRRC4缺失導(dǎo)致了Th1免疫反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)功能減弱，這可能加速了EAE的進(jìn)程。
圖6.LRRC4缺失導(dǎo)致更嚴(yán)重的Th1免疫反應(yīng)
4、過表達(dá)LRRC4減輕EAE進(jìn)展
在證明了LRRC4在EAE小鼠中表達(dá)下調(diào)，并且LRRC4缺失會(huì)加劇EAE進(jìn)程后，研究者猜測異位表達(dá)LRRC4是否可以修復(fù)EAE的病理缺陷。因此，使用腺相關(guān)病毒（AAV-LRRC4）對(duì)小鼠進(jìn)行過表達(dá)LRRC4處理，注射10 d后用MOG35-55誘導(dǎo)EAE并進(jìn)行臨床評(píng)分以及組織染色研究。結(jié)果表明LRRC4的過表達(dá)減緩了EAE的進(jìn)程，同時(shí)也減輕了EAE引起的脫髓鞘和自身免疫缺陷。因此，研究者提出AAV-LRRC4病毒可能被用作治療MS患者的治療工具，為MS疾病的治療提供新的方法。
圖7.過表達(dá)LRRC4減輕EAE發(fā)展進(jìn)程
結(jié)論意義
本研究證實(shí)了LRRC4在EAE中的關(guān)鍵作用，EAE小鼠脊髓中LRRC4表達(dá)減少。LRRC4主要在神經(jīng)元中表達(dá)，并在EAE小鼠中發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元作用；LRRC4缺失后會(huì)加劇脫髓鞘、神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥，NF-κB p65升高，p-AKT降低，導(dǎo)致IFN-γ和IL-6上調(diào)，IL-10、TNF-α和TGF-β下調(diào)，導(dǎo)致Th1細(xì)胞增加和Treg細(xì)胞減少。外源增加LRRC4的表達(dá)可能為防止EAE惡化和治療提供新的治療策略，并可作為MS輔助支持治療的潛在靶點(diǎn)。
