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Protein&Cell｜浙大夏宏光教授課題組揭示二甲雙胍治療阿爾茨海默病新機(jī)制

無標(biāo)題文檔

近期，浙大夏宏光教授課題組在《Protein&Cell》（IF=14.971）上發(fā)表了題為“Metformin activates chaperone-mediated autophagy and improves disease pathologies in an Alzheimer disease mouse model”的研究成果，文章首次描述了二甲雙胍誘導(dǎo)CMA（分子伴侶介導(dǎo)的自噬）的機(jī)制，即通過激活TAK1-IKKα/β信號通路，使熱休克蛋白Hsc70 Ser85發(fā)生磷酸化并被激活從而調(diào)控CMA進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)APP是CMA的底物，能以IKKα/β依賴的方式與Hsc70結(jié)合，抑制CMA介導(dǎo)的APP降解能增強(qiáng)細(xì)胞毒性。此外，在APP/PS1 AD小鼠模型中，Hsc70過表達(dá)或二甲雙胍激活CMA可以有效降低腦區(qū)Aβ斑塊積累水平，并逆轉(zhuǎn)AD的分子和行為表型。該研究確定了二甲雙胍可作為CMA的新型激活劑，并可作為治療AD的有效藥物，同時也為治療CMA相關(guān)疾病提出了一種有利證據(jù)。

二甲雙胍誘導(dǎo)CMA的激活機(jī)制

維真生物AAV病毒產(chǎn)品為本研究助力！

病毒產(chǎn)品：AAV8-CAG-mCherry；

AAV8-CAG-Hsc70WT-Flag-P2A-mCherry；

AAV8-CAG-Hsc70(S85A)-Flag-P2A-mCherry；

種屬：16周齡APP/PS1小鼠

注射方式：立體定位注射小鼠海馬區(qū)

注射量：1.5μL ，0.3μL/min

檢測時間：注射后12周

1. 研究背景

阿爾茨海默病(Alzheimer 's disease, AD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力減退等，其病理特征包括Aβ蛋白沉積和Tau蛋白過度磷酸化。已知Aβ蛋白來源于淀粉樣前體蛋白(APP)，CMA激活能夠降低Tau蛋白水平，因此利用藥物促進(jìn)APP的清除，并尋找安全有效的CMA激活藥物，可能是治療AD的潛在策略。然而CMA在調(diào)節(jié)Aβ蛋白水平中的作用尚未被證實(shí)，此外，目前也缺乏一種能安全有效激活CMA的藥物，阻礙了通過CMA激活策略治療相關(guān)疾病可行性的研究。二甲雙胍是一種廣泛用于治療2型糖尿病的口服藥物，安全性高，研究表明二甲雙胍不僅對一些癌癥具有有益作用，還可以抑制慢性炎癥、抗衰老，并可能保護(hù)認(rèn)知功能。但是二甲雙胍是否可用于阿爾茨海默病的有效治療，目前尚不明確。

2. 研究思路

首先，本研究通過藥物篩選確認(rèn)二甲雙胍是一種新型的CMA激活劑，可以激活I(lǐng)KKα/β激酶，進(jìn)而磷酸化并激活Hsc70。此外，作者通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能降低APP/PS1的AD小鼠模型中Aβ水平，進(jìn)而改善小鼠的認(rèn)知障礙。最后，作者利用AAV載體介導(dǎo)Hsc70在APP/PS1的AD小鼠海馬區(qū)的過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hsc70過表達(dá)能夠顯著減輕AD的病理過程。

3. 研究結(jié)果分享

1. 二甲雙胍激活CMA

首先，研究者利用293THK細(xì)胞（監(jiān)測CMA活性的功能性報告系統(tǒng)）和高通量流式細(xì)胞術(shù)篩選了能有效激活CMA的藥物。在2197種FDA批準(zhǔn)的藥物或候選藥物中，篩選出了廣泛用于治療2型糖尿病的藥物二甲雙胍，二甲雙胍在Lamp2a（溶酶體受體，介導(dǎo)CMA底物進(jìn)入溶酶體）正常表達(dá)情況下能誘導(dǎo)HK2-GFP水平下降，而在Lamp2a敲低時則不能。

用二甲雙胍處理293THK細(xì)胞后，HK2-GFP蛋白水平下降，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，而下調(diào)Hsc70表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了二甲雙胍對HK2-GFP的影響。此外，二甲雙胍還能誘導(dǎo)兩種內(nèi)源性CMA底物HK2和PKM2的降解，并可被溶酶體抑制劑（如E-64D，BafA等）而非蛋白酶抑制劑所抑制，證明此降解過程依賴于溶酶體。而Hsc70和Lamp2a的敲低阻斷了二甲雙胍誘導(dǎo)的內(nèi)源性HK2和PKM2的降解，pull-down和PLA技術(shù)均證實(shí)二甲雙胍誘導(dǎo)內(nèi)源性HK2和PKM2與Hsc70 和 Lamp2a相互作用，此外還排除了宏自噬在此過程中的作用，證實(shí)這些蛋白的降解依賴于CMA。

上述研究結(jié)果表明，二甲雙胍能夠以溶酶體、Hsc70和Lamp2a依賴的方式激活CMA，觸發(fā)其底物的降解，并促進(jìn)它們與Hsc70和LAMP2A的相互作用。

圖1. 二甲雙胍激活CMA

2. 二甲雙胍通過Hsc70的Ser85磷酸化激活CMA

研究者發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍誘導(dǎo)的HK2-GFP熒光和蛋白水平的降低可以通過過表達(dá)λ-磷酸酶來挽救，這表明磷酸化是導(dǎo)致HK2-GFP降解的原因。通過對二甲雙胍處理的細(xì)胞Hsc70-Flag免疫沉淀進(jìn)行質(zhì)譜磷酸化分析，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可誘導(dǎo)Hsc70第85位絲氨酸發(fā)生磷酸化，其非磷酸化突變體Hsc70-S85A可顯著降低二甲雙胍誘導(dǎo)的Hsc70與CMA底物蛋白之間的相互作用。過表達(dá)Hsc70-WT而非Hsc70-S85A可降低CMA底物HK2和PKM2的蛋白水平，而敲低Lamp2a可以阻止此降解反應(yīng)。這些結(jié)果表明，二甲雙胍通過Hsc70 Ser85磷酸化激活CMA，促進(jìn)Hsc70與CMA底物蛋白的相互作用。

圖2. 二甲雙胍通過Hsc70的Ser85磷酸化激活CMA

3. 二甲雙胍激活TAK1-IKKα/β信號通路，進(jìn)而磷酸化Hsc70 Ser85

與二甲雙胍誘導(dǎo)的CMA活化與AMPK無關(guān)一致，Hsc70 Ser85位點(diǎn)的磷酸化也與AMPK激活無關(guān)，研究者發(fā)現(xiàn)Hsc70 Ser85是IKKα/β的預(yù)測潛在靶點(diǎn)。體外激酶檢測實(shí)驗(yàn)顯示Hsc70的Ser85位點(diǎn)能被IKKα和IKKβ直接磷酸化，且IKKα和IKKβ的結(jié)合進(jìn)一步加強(qiáng)了磷酸化。二甲雙胍處理后，IKKα或IKKβ與Hsc70的相互作用增加，這表明IKKα/β在Ser85處磷酸Hsc70。敲低293THK細(xì)胞中的IKKα和IKKβ再用二甲雙胍處理，發(fā)現(xiàn)IKKα/β敲低可以降低p-Hsc70 Ser85水平并阻止內(nèi)源性HK2和PKM2的降解，挽救二甲雙胍誘導(dǎo)的HK2-GFP熒光和蛋白質(zhì)水平的降低，二者過表達(dá)則增加了p-Hsc70 Ser85水平，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，Hsc70 Ser85磷酸化的上游激酶是IKKα/β。

已知TAK1（轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1）能磷酸化并激活I(lǐng)KKα/β激酶，由此研究者驗(yàn)證了二甲雙胍誘導(dǎo)的IKK和CMA激活是否依賴于TAK1。研究者發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TAK1挽救了二甲雙胍誘導(dǎo)的HK2-GFP水平下降、內(nèi)源性HK2和PKM2的降解以及IKKα/β、Hsc70 Ser85的磷酸化，這說明二甲雙胍可激活TAK1，進(jìn)而磷酸化并激活I(lǐng)KKα/β， IKKα/β再磷酸化Hsc70誘導(dǎo)CMA的激活。體外熱位移法檢測證明二甲雙胍與TAK1之間沒有直接的相互作用，即TAK1不是二甲雙胍的直接靶點(diǎn)，但它參與了二甲雙胍誘導(dǎo)的CMA激活。

圖3. 二甲雙胍激活TAK1-IKKα/β信號通路

4. APP是CMA的底物

隨后，研究者研究了二甲雙胍激活CMA后APP是否可以被靶向降解，發(fā)現(xiàn)甲雙胍以溶酶體、Hsc70和LAMP2A依賴的方式誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性APP蛋白的降解。同時，也增強(qiáng)了內(nèi)源APP與Hsc70-Flag以及LAMP2A-Flag之間的相互作用，且Hsc70-Flag與APP的相互作用能被Hsc70的S85A突變所阻斷。值得注意的是，抑制IKKβ和TAK1的表達(dá)可以阻斷二甲雙胍誘導(dǎo)的APP降解，同時阻斷Hsc70（Ser85）和IKKα/β（Ser176/180）的磷酸化。這些結(jié)果表明，APP是CMA的底物，二甲雙胍可以通過激活TAK1-IKKα/β-Hsc70-CMA途徑來誘導(dǎo)其降解。

圖4. 二甲雙胍通過激活CMA誘導(dǎo)APP降解

5. 二甲雙胍激活CMA或Hsc70過表達(dá)可改善APP/PS1小鼠認(rèn)知功能缺陷

經(jīng)過探究研究者發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍誘導(dǎo)的CMA激活可以誘導(dǎo)APP降解并減輕APP和Aβ的細(xì)胞毒性作用。接著，研究者又對APP/PS1小鼠進(jìn)行了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，探索了二甲雙胍誘導(dǎo)的CMA活化對小鼠記憶喪失及AD相關(guān)分子標(biāo)志物的影響，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理后，APP/PS1小鼠的學(xué)習(xí)和空間記憶得到了明顯改善，整個大腦中不溶性Aβ1-42水平顯著下降，海馬中Aβ斑塊水平下降。GFAP染色發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活也有所降低。此外，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，二甲雙胍處理也顯著降低了APP蛋白水平，并誘導(dǎo)了Hsc70 Ser85位點(diǎn)的磷酸化。

為驗(yàn)證Hsc70過表達(dá)激活CMA是否也可以緩解APP/PS1表型，研究者利用AAV在小鼠的海馬區(qū)對Hsc70 WT和Hsc70-S85A進(jìn)行了過表達(dá)。發(fā)現(xiàn)Hsc70 WT過表達(dá)減輕了APP/PS1小鼠的認(rèn)知缺陷，并且有效降低了APP/PS1小鼠腦組織中不溶性Aβ1-42水平及其海馬區(qū)Aβ斑塊水平和APP蛋白水平。這一結(jié)果表明，通過二甲雙胍或過表達(dá)Hsc70激活CMA可降低不溶性Aβ1-42積累、Aβ斑塊水平，誘導(dǎo)APP降解，從而緩解APP/PS1小鼠的認(rèn)知缺陷。

圖5. 二甲雙胍激活CMA有效緩解阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知缺陷

4. 小結(jié)

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)降糖藥物二甲雙胍可作為CMA的激活劑，同時也證實(shí)了APP是CMA的底物，二甲雙胍可以通過激活TAK1-IKKα/β-Hsc70-CMA途徑來誘導(dǎo)其降解，進(jìn)而改善AD小鼠的認(rèn)知缺陷；除了作為治療2型糖尿病的臨床藥物，二甲雙胍也初次被證實(shí)具有用于治療AD疾病的可行性?？傊撗芯拷沂玖硕纂p胍通過激活分子伴侶介導(dǎo)自噬治療 AD 的新機(jī)制，為AD等相關(guān)退行性神經(jīng)疾病的治療提供了一種潛在的治療策略。