Molecular Cell｜北大劉濤教授課題組開發(fā)cCas12a平臺(tái)，大大提高Cas12a系統(tǒng)基因編輯效率！
Molecular Cell｜北大劉濤教授課題組開發(fā)cCas12a平臺(tái)，大大提高Cas12a系統(tǒng)基因編輯效率！
近期，北京大學(xué)劉濤教授課題組在Molecular Cell （IF=17.970）上發(fā)表了題為“Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates”的研究論文，文章報(bào)道了利用生物正交化學(xué)方法，將位點(diǎn)特異性修飾的Cas12a蛋白和5’端化學(xué)修飾的crRNA生成共價(jià)Cas12a-crRNA復(fù)合物（cCas12a），不僅提高了Cas12a系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因組編輯效率，還能夠用于CAR-T細(xì)胞制備中的精確基因敲入和多重基因編輯。本研究為Cas12a系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為改造其它低效的Cas家族成員提供了潛在思路。
01 研究背景
CRISPR/Cas系統(tǒng)已被廣泛用于哺乳動(dòng)物等多個(gè)物種的基因組編輯。哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因編輯中常用的Cas酶除了熟知的Cas9蛋白外，還有V型Cas12a蛋白。區(qū)別于Cas9蛋白，Cas12a具有以下特點(diǎn)：①只需單個(gè)crRNA，且體積更小、更易被遞送至細(xì)胞中；②Cas12a切割后產(chǎn)生粘性末端，更利于基因組精確編輯；③識(shí)別的PAM序列（TTTN）不一致；④Cas12a的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)，為連續(xù)多次編輯提供了可能性；⑤脫靶率相對(duì)較低。這些特點(diǎn)使CRISPR/Cas12a系統(tǒng)成為臨床應(yīng)用中的一種潛在更安全的選擇。然而，CRISPR/Cas12a系統(tǒng)也存在局限性—基因編輯效率相對(duì)低下 ，這一點(diǎn)大大限制了該系統(tǒng)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。研究報(bào)道，Cas12a核酸酶只能與一種約42nt的crRNA結(jié)合，且二者親和力較弱。研究者推測(cè)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的低編輯效率可能與Cas12a和crRNA的弱結(jié)合力有關(guān),增強(qiáng)二者間的相互作用可能是提高該系統(tǒng)編輯效率的突破口。
02 設(shè)計(jì)思路
針對(duì)Cas12a和crRNA的弱結(jié)合力問題，研究人員提出了Cas12a與crRNA共價(jià)交聯(lián)的策略，通過基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)在Cas12a核酸酶上定點(diǎn)引入了含有疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸，結(jié)合蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析，得到位點(diǎn)特異性修飾的Cas12a蛋白，并與5’端DBCO（二苯并環(huán)辛炔）修飾的crRNA共價(jià)偶聯(lián)，生成了有活性的核糖核蛋白復(fù)合物（RNP）。此策略將Cas12a和crRNA共價(jià)連接成一個(gè)組分，RNP復(fù)合物可以直接傳遞到細(xì)胞中，在到達(dá)目標(biāo)位點(diǎn)之前共價(jià)鍵還可以防止復(fù)合物解離，安全性及準(zhǔn)確性均較高。
Cas12a-crRNA復(fù)合物的開發(fā)
03 研究結(jié)果分享
1.cCas12a的設(shè)計(jì)與生成
研究表明，Cas12a crRNA的5’端經(jīng)修飾后活性不會(huì)受影響，由此研究人員嘗試將crRNA的5’端與Cas12a共價(jià)結(jié)合。首先確定了合適的交聯(lián)位點(diǎn)為AsCas12a（來自氨基酸球菌屬）蛋白的第806位甲硫氨酸（M806）,并通過非典型氨基酸誘變技術(shù)將其替換為含疊氮基團(tuán)的非天然氨基酸AeF，生成了突變體AzCas12a。經(jīng)體外DNA切割等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)AzCas12a與WT Cas12a具有相同的的核酸酶活性。隨后，研究人員將5’DBCO修飾的crRNA通過疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)共價(jià)連接到AzCas12a，生成了cCas12a RNP復(fù)合物。體外DNA切割試驗(yàn)證實(shí)了cCas12a RNP復(fù)合物的核酸酶活性。
圖1. 位點(diǎn)特異性疊氮基修飾Cas12a的生成及與5’端修飾crRNA的共價(jià)結(jié)合
2.CRISPR/cCas12a在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編輯效率大大提高
cCas12a RNP復(fù)合物生成后，研究人員對(duì)其切割效率進(jìn)行了驗(yàn)證：在HEK293-EGFP- Teton細(xì)胞中，cCas12a RNP對(duì)EGFP基因的編輯效率約是WT Cas12a和非共軛AzCas12a的3倍，而對(duì)HEK293細(xì)胞中5個(gè)內(nèi)源性基因位點(diǎn)的編輯效率提高了1.6-18.3倍；在3種難轉(zhuǎn)染細(xì)胞（K562、Jurkat和NIH/3T3）中,cCas12a RNP對(duì)相關(guān)基因的編輯效率也大大提高（2~4倍）。這說明， Cas12a與crRNA共價(jià)交聯(lián)可以大幅提高不同細(xì)胞中不同位點(diǎn)的基因編輯效率。
圖2. CRISPR/cCas12a在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因編輯效率大大提高
3.CRISPR/cCas12a脫靶效應(yīng)的評(píng)估
接下來，研究人員對(duì)CRISPR/cCas12a的脫靶效率進(jìn)行了評(píng)估。首先，使用GUIDE-seq方法評(píng)估了cCas12a和WT Cas12a RNPs對(duì)HEK293細(xì)胞中三個(gè)不同基因位點(diǎn)（hHPRT1、GUK1和DNMT1）的靶效率和脫靶效率。結(jié)果表明，cCas12a對(duì)3個(gè)基因的打靶率增加了2-6倍。此外，cCas12a對(duì)hHPRT1和GUK1基因的脫靶切割未檢測(cè)到。對(duì)于本身脫靶率極高的DNMT1基因，研究人員也確實(shí)檢測(cè)到了cCas12a對(duì)DNMT1的非靶向切割。這些數(shù)據(jù)表明，cCas12a RNP復(fù)合物可以大幅提高基因的靶上編輯效率，而脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)可能取決于crRNA的內(nèi)在序列特異性。
圖3. CRISPR/cCas12a脫靶效應(yīng)的評(píng)估
4.共價(jià)交聯(lián)策略在Cas12a家族的擴(kuò)展應(yīng)用
除了可將AsCas12a與crRNA共價(jià)交聯(lián)外，研究人員還將此共價(jià)交聯(lián)策略成功應(yīng)用于其它Cas12a家族蛋白——LbCas12a（來自毛螺菌科細(xì)菌），同樣地，選擇了合適的交聯(lián)位點(diǎn)H759，將其突變?yōu)镠759AeF，并與修飾的crRNA共價(jià)交聯(lián)，生成LbCas12a RNP復(fù)合物。體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LbCas12a RNP對(duì)基因的切割效率為WT LbCas12a的1.7倍，證實(shí)了共價(jià)交聯(lián)策略也可用于其他Cas12a家族成員 。此外，研究人員進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)此共價(jià)交聯(lián)策略還可應(yīng)用于其它現(xiàn)有的Cas12a突變體及基于Cas12a的堿基編輯器（見原文補(bǔ)充結(jié)果3）。
5.CRISPR/cCas12a提高了HDR介導(dǎo)的精確基因敲入效率
已知Cas12a的切割位點(diǎn)遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)，在插入/缺失形成后的目標(biāo)位點(diǎn)上提供額外的切割機(jī)會(huì)，增加了HDR介導(dǎo)的基因整合機(jī)會(huì)。因此作者探究了cCas12a RNP是否也能提高HDR效率，將cCas12a RNP和靶向hHPRT1基因的帶有EcoRI識(shí)別位點(diǎn)的單鏈供體DNA電轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，cCas12a RNPs的HDR效率是WT Cas12a的7-8倍，證實(shí)了CRISPR/cCas12a可以提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基于Cas12a的HDR效率。
圖4. CRISPR/cCas12a提高了HDR介導(dǎo)的精確基因敲入效率
6.cCas12a 提高了位點(diǎn)特異性整合的CAR-T細(xì)胞制備效率
CAR-T細(xì)胞免疫療法是目前極具前景的腫瘤治療方式之一，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用有望改善當(dāng)前和發(fā)展中的CAR-T細(xì)胞免疫治療策略。研究報(bào)道，Cas12a結(jié)合AAV載體遞送策略制備的CAR-T細(xì)胞效率更高。那么，cCas12a平臺(tái)是否可以用于CAR-T細(xì)胞的制備呢？對(duì)此研究人員進(jìn)行了探究。將WT Cas12a和cCas12a RNP電擊導(dǎo)入人原代T細(xì)胞，對(duì)內(nèi)源性TRAC基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除，隨后用 AAV6-CD19 CAR（維真生物包裝助力） 感染T細(xì)胞，使CAR基因定點(diǎn)重組至TRAC基因座中。流式檢測(cè)CAR敲入效率，結(jié)果顯示cCas12a對(duì)CAR的敲入效率是WT Cas12a的近2倍。對(duì)WT Cas12a和cCas12a制備的CAR陽性細(xì)胞免疫學(xué)特性分析顯示，cCas12a制備的CAR-T細(xì)胞免疫特性與WT Cas12a相同。上述結(jié)果表明，cCas12a系統(tǒng)提高了CAR-T細(xì)胞的制備效率，并且T細(xì)胞經(jīng)cCas12a處理后的免疫特性與WT Cas12a系統(tǒng)相同，表明cCas12a系統(tǒng)在T細(xì)胞工程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
圖5. 利用cCas12a在人原代T細(xì)胞中進(jìn)行CAR整合
7.利用cCas12進(jìn)行高效的多重基因組編輯制備通用CAR-T細(xì)胞
目前臨床上多使用自體T細(xì)胞進(jìn)行CAR-T細(xì)胞免疫治療，但受自體T細(xì)胞質(zhì)量、數(shù)量及時(shí)間和成本等因素的限制，基于CRISPR系統(tǒng)制備通用CAR-T細(xì)胞可以避免這些限制。研究人員利用cCas12a進(jìn)行了T細(xì)胞中多重基因編輯，同時(shí)敲除了內(nèi)源性TRAC, β-2微球蛋白 (β2M), PD1與CTLA4基因，同時(shí)在TRAC位點(diǎn)定點(diǎn)敲入了CAR基因，制備了通用型CAR-T細(xì)胞。多重基因敲除效果檢測(cè)顯示無論是同時(shí)敲除雙基因、三基因還是四基因，與WT Cas12a系統(tǒng)相比，cCas12a系統(tǒng)的多基因編輯效率均更高，證實(shí)cCas12a可以進(jìn)行高效地多重基因組編輯，用于制備通用CAR-T細(xì)胞。
圖6. 利用cCas12a介導(dǎo)的多基因編輯高效生成通用CAR-T細(xì)胞
04 小結(jié)
綜上所述，研究人員利用共價(jià)交聯(lián)策略生成的Cas12a蛋白與crRNA的復(fù)合物cCas12a不僅大幅提高了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基于Cas12a的基因組編輯效率，并且可以應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞制備的精確基因整合和多重基因編輯，為高效的哺乳動(dòng)物細(xì)胞工程提供了有用的工具，有望推動(dòng)新一代更安全可控的免疫細(xì)胞制備。
