Bioactive Materials ‖湖南大學胡小曉團隊揭示核酸適體S11e特異性識別纖維肉瘤并抑制腫瘤生長的機制
湖南大學胡小曉團隊與3保1 shRNA慢病毒
近日，湖南大學胡小曉副教授團隊在綜合性國際學術(shù)期刊《Bioactive Materials》上發(fā)表了“DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor”的研究論文，該團隊篩選出了一條能特異性識別纖維肉瘤的核酸適體，確定了其目標功能靶點Diablo/SMAC，并初步揭示了核酸適體S11e促進纖維肉瘤凋亡機制并抑制其遷移和侵襲。
維真生物慢病毒
基因信息
人源Diablo/SMAC基因（促凋亡作用）
病毒產(chǎn)品
Diablo/SMAC 3保1 shRNA 慢病毒
細胞類型
人纖維肉瘤細胞HT1080
用法
病毒感染24h后puro篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株
MOI
MOI : 1 MOI : 4
研究背景
纖維肉瘤是一種侵襲性強、復發(fā)率高、預后差的惡性腫瘤，可以發(fā)生在任何年齡、人體纖維組織的每一個部位。目前，手術(shù)切除是纖維肉瘤的主要治療方法，但由于缺乏特異性的生物標記物，無法準確診斷纖維肉瘤可能導致不理想的切除手術(shù)結(jié)果，并降低生存率。因此，為了潛在地解決這一臨床需求，探究分子探針用于早期診斷和靶向治療和纖維肉瘤準確的預測至關(guān)重要。
研究思路
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)核酸適體S11e能夠識別纖維肉瘤細胞(HT1080)，并且S11e能在HT1080異種移植小鼠模型和纖維肉瘤患者的腫瘤組織中識別腫瘤。此外，作者還證實了S11e不依賴于溶酶體途徑而內(nèi)化到HT1080細胞中，并位于線粒體中。不僅如此，還發(fā)現(xiàn)S11e促進了HT1080細胞的凋亡，并抑制了HT1080細胞的遷移。最后，作者利用質(zhì)譜方法研究了S11e的生物功能細胞靶點，發(fā)現(xiàn)Diablo/ SMAC蛋白是S11e的細胞結(jié)合蛋白，通過與S11e相互作用抑制HT1080細胞的遷移和侵襲。綜上所述，這些結(jié)果表明S11e可能有助于纖維肉瘤的早期診斷、靶向治療和預后。
部分研究成果分享
1. S11e在HT1080細胞中的細胞器共定位
首先，作者利用流式細胞術(shù)檢測HT1080與已有的具有已知序列的核酸適體的結(jié)合能力，成功的鑒定到與HT1080有高親和力的S11e。接著，分析探討了S11e在HT1080細胞中的細胞器共定位，發(fā)現(xiàn)溶酶體追蹤器和cy5標記的S11e的熒光信號沒有重疊，線粒體熒光探針Mito-tracker和cy5標記的S11e熒光信號在4℃完全重疊，表明S11e可以定位于HT1080細胞的線粒體。此外，S11e可以在不被溶酶體內(nèi)化的情況下成功逃逸到線粒體中，使S11e成為一種極好的潛在載體，可以保護自己免受溶酶體中各種消化酶的降解。
圖1.HT1080細胞與Cy5-S11e(紅色)和Mito-tracker及Lyso-track(綠色)的共定位
2. S11e特異性識別腫瘤組織
核酸適體識別體內(nèi)腫瘤的能力是評價能否應用于臨床的重要指標。為此作者將修飾后的核酸適體通過尾靜脈注射小鼠，發(fā)現(xiàn)注射后5min，S11e在腫瘤部位的熒光信號增強，而Library在腫瘤部位未見明顯熒光信號，說明S11e在腫瘤部位聚集。通過觀察Cy5標記的S11e在小鼠體內(nèi)的生物學分布，發(fā)現(xiàn)S11e在體內(nèi)具有靶向纖維肉瘤的能力。
圖2. S11e在HT1080異種移植小鼠模型中的熒光成像
作者進一步通過將Cy5和Cy5標記S11e與纖維組織病理切片共同孵育，發(fā)現(xiàn)正常組織中未見紅色Cy5熒光信號，良性腫瘤組織中可見輕微紅色熒光信號，惡性腫瘤組織中可見強紅色熒光信號，表明S11e在體外可以識別纖維肉瘤組織。
圖3.S11e識別患者組織樣本中的腫瘤細胞
3. S11e促進纖維肉瘤細胞凋亡并引起相關(guān)蛋白表達的改變
為研究S11e的生物學功能，作者進行了細胞毒性實驗。分別用S11e和Library（隨機文庫）處理HT1080細胞后，細胞活力分別為49.08%和93.42%，說明S11e而不是Library對HT1080細胞具有細胞毒性作用。綜上所述，S11e可有效誘導HT1080細胞凋亡，提示S11e對腫瘤細胞具有潛在的治療作用。
圖4. S11e或Library對HT1080和MRC-5細胞毒性分析
接下來，作者利用Western blotting實驗對S11e誘導HT1080細胞凋亡的途徑進行了進一步探究。發(fā)現(xiàn)HT1080細胞與S11e孵育后，cleaved- caspase -9 (37 kDa)、cleaved- caspase -3 (17 kDa)和cleaved- PARP (89 kDa)的表達增加。當Caspase-9被激活時，Caspase-3被激活，Caspase-3進一步切割凋亡的關(guān)鍵酶PARP，直接誘導凋亡。這些結(jié)果表明，S11e特異性地通過線粒體介導的內(nèi)源性凋亡途徑誘導細胞凋亡。
圖5. S11e或Library 處理后，HT1080細胞中凋亡蛋白的表達
4. Diablo/SMAC是S11e結(jié)合的功能性細胞蛋白
接下來，作者探究了與S11e結(jié)合的功能性細胞蛋白。有趣的是，在S11e處理的細胞中特異檢測到分子量為85 kDa和20 kDa的兩條蛋白帶，而在Library處理的細胞中檢測不到。通過重點篩選分子量在15-25 kDa至70-90 kDa之間的蛋白，然后用S11e與Library的評分比對其進行排序，發(fā)現(xiàn)Diablo/SMAC (21 kDa)在凋亡觸發(fā)后可以從線粒體膜間隙釋放到細胞溶膠，與其他攻擊相比排名較高。因此，作者推測Diablo/SMAC是S11e的潛在結(jié)合靶點。
圖6.S11e結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析
為證實上述推測，作者使用三條獨立的Diablo/SMAC特異性shRNA進行了功能缺失分析，其中shSMAC 1和shSMAC 2對Diablo/SMAC干擾效果更加顯著。
圖7.Diablo/SMAC shRNA敲除效果
作者還對經(jīng)S11e處理的Diablo/SMAC沉默的HT1080細胞進行了細胞劃痕和侵襲實驗。結(jié)果表明，SMAC的表達降低后，S11e對HT1080細胞遷移和侵襲的抑制作用被消除，上述結(jié)果證實，SMAC是纖維肉瘤細胞中S11e的功能性結(jié)合靶點。
圖8.Diablo/SMAC為S11e的功能結(jié)合蛋白
小結(jié)
綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)核酸適體S11e可以特異性識別纖維肉瘤細胞，并且S11e能在HT1080異種移植小鼠模型和纖維肉瘤患者的腫瘤組織中識別腫瘤組織；同時發(fā)現(xiàn)S11e可以促進HT1080細胞的凋亡并抑制了HT1080細胞的遷移。此外，確定了Diablo/ SMAC蛋白是S11e的細胞結(jié)合蛋白，通過與S11e相互作用抑制HT1080細胞的遷移和侵襲。
本研究為S11e作為纖維肉瘤的早期診斷、靶向治療和預后的有效工具提供了新的見解。
