AAV-PCSK9讓你的動(dòng)脈粥樣硬化造模更簡(jiǎn)單！
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1. 動(dòng)脈粥樣硬化簡(jiǎn)介
目前，心腦血管疾病在人群中的發(fā)病率越來越高，其發(fā)病基礎(chǔ)主要是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS） 。動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性進(jìn)行性疾病，發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，目前尚未明了，有多種學(xué)說從不同角度來闡明，諸如脂肪浸潤(rùn)學(xué)說、血栓形成和血小板聚集學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說和克隆學(xué)說等，近年來，內(nèi)皮損傷學(xué)說逐漸被公認(rèn)。即多種因素使內(nèi)皮細(xì)胞受損，使動(dòng)脈內(nèi)膜的完整性受到破壞，加上脂質(zhì)代謝紊亂，血液中的脂蛋白從受損的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入動(dòng)脈壁，引起平滑肌細(xì)胞的增生，隨著脂質(zhì)的不斷沉積和平滑肌細(xì)胞的持續(xù)增生，并經(jīng)過一系列復(fù)雜的連鎖反應(yīng)和惡性循環(huán)形成動(dòng)脈硬化。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展為其治療提供了很多選擇，但它仍然是世界范圍內(nèi)的造成死亡的主要原因之一，因此，研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及其影響因素尤為重要。
2. PCSK9簡(jiǎn)介及其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用
PCSK9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9） ，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶9，kexin樣前轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第九個(gè)成員，定位于1p32.3染色體，由692個(gè)氨基酸組成，是脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。PCSK9屬于細(xì)胞內(nèi)“轉(zhuǎn)化酶”或脫羧酶, 在嚙齒類動(dòng)物中，PCSK9主要在成年肝細(xì)胞中表達(dá)，在小腸和腎臟中表達(dá)較少，在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中短暫表達(dá)；在成人中，PCSK9主要在肝臟中表達(dá), 在小腸、腎臟、腦等中也有少量表達(dá)。研究表明，PCSK9在內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)，對(duì)血管穩(wěn)態(tài)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊產(chǎn)生局部影響。
肝臟是脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的主要部位，肝細(xì)胞通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor, LDLR）的主要調(diào)節(jié)因子PCSK9來控制血液中的低密度脂蛋白（LDL）水平。PCSK9由肝臟分泌到血漿中，與肝細(xì)胞表面的LDLR結(jié)合，構(gòu)成復(fù)合物并靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解, 從而阻斷LDLR在細(xì)胞膜表面的循環(huán)途徑, 使得血漿中LDL升高, 最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。此外，PCSK9還會(huì)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、粘附分子和趨化劑的表達(dá)，從而增加單核細(xì)胞的募集、炎癥細(xì)胞的粘附和動(dòng)脈粥樣硬化血管壁的炎癥。目前，PCSK9已經(jīng)成為降脂藥物研發(fā)及動(dòng)脈粥樣硬化干預(yù)的熱門靶點(diǎn)。
圖1. PCSK9與肝細(xì)胞LDLR結(jié)合
3. AAV-PCSK9 造模方法
動(dòng)脈粥樣硬化模型對(duì)于我們了解疾病的發(fā)病機(jī)制，并開發(fā)其治療方法具有重大意義。目前，載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）和低密度脂蛋白受體缺陷（LDLR-/-）小鼠是應(yīng)用比較廣泛的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，但是，這些通過生殖系基因工程技術(shù)在小鼠內(nèi)建立的模型需要復(fù)雜而耗時(shí)的回交。近年來，科學(xué)家建立了一種快速、簡(jiǎn)便、通用和經(jīng)濟(jì)有效的無(wú)種系遺傳工程的建模方法：單次靜脈注射AAV-PCSK9DY。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
C57BL/6NTac小鼠
病毒名稱
AAV8-D377Y-mPCSK9 & AAV8-D374Y-hPCSK9
病毒用量
2×10E10vg（●）1×10E11vg（■）5×10E11vg（▲）
注射方式
單次尾靜脈注射
建模方法
次日喂食西方飼料（含21%的脂肪和0.21%的膽固醇）或Paigen飼料（含16%的脂肪、1.25%的膽固醇和0.5%的膽酸鈉）12周
PCSK9的功能獲得性突變PCSK9DY可以誘發(fā)高膽固醇血癥，研究表明，PCSK9DY與 LDLR的體外親和性相比野生型 PCSK9至少高出10倍， 其誘發(fā)高膽固醇血癥的作用更強(qiáng)。為了實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的高膽固醇血癥，研究者將不同劑量的重組腺相關(guān)病毒載體（人源及小鼠PCSK9DY載體設(shè)計(jì)圖見圖2）注射至C57BL/6NTac小鼠中，然后進(jìn)行高脂飲食，12周后，小鼠出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化，主要表現(xiàn)在主動(dòng)脈弓或主動(dòng)脈根（圖3）。
圖2. PCSK9DY載體示意圖
圖3. AAV-PCSK9DY誘導(dǎo)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化
4. 維真AAV-PCSK9應(yīng)用實(shí)例
“Smooth muscle-specific HuR knockout induces defective autophagy and atherosclerosis ” 【點(diǎn)擊查看原文】
人類抗原R(Human antigen R，HuR)是一種廣泛存在的RNA結(jié)合蛋白，參與多種疾病的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)和病理過程，但是其在AS中的作用尚不明確。在這項(xiàng)研究中，作者建立了平滑肌特異性HuR基因敲除的小鼠模型(HuRsmko)，以研究HuR在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。發(fā)現(xiàn)HuR在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)降低，與對(duì)照組相比，HuRsmko小鼠在動(dòng)脈粥樣硬化模型中顯示出更多的斑塊。HuR能與AMPKα1和AMPKα2結(jié)合，增加其穩(wěn)定性和蛋白表達(dá)。HuR缺乏降低了p-AMPK和LC3II水平，增加了p62水平，從而導(dǎo)致自噬缺陷。而藥理學(xué)AMPK激活誘導(dǎo)HuRsmko小鼠的自噬并抑制動(dòng)脈粥樣硬化。本研究表明，平滑肌HuR可以通過增加AMPK介導(dǎo)的自噬，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到保護(hù)作用 。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
8周齡雄性HuRsmko 小鼠
病毒名稱
rAAV/D377Y-mPCSK9
注射方式
單次尾靜脈注射
病毒用量
1.5×10E11
建模方法
喂食Paigen飼料12周
為研究HuR在AS中的作用機(jī)制，研究人員構(gòu)建了平滑肌特異性HuR基因敲除（HuRsmko）小鼠模型，然后注射rAAV/D377Y-mPCSK9載體并喂食Paigen飼料12周以誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化 。發(fā)現(xiàn)HuRsmko小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化表面病變比例明顯高于對(duì)照組，且主動(dòng)脈根病變面積顯著增加。同時(shí)，HuR的缺失增加了巨噬細(xì)胞的積累和基質(zhì)金屬酶2（MMP2）的水平，降低了膠原含量，表明VMSC中HuR的缺失促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展（圖4）。
圖4. 平滑肌細(xì)胞中HuR缺失加重動(dòng)脈粥樣硬化
5. 維真AAV-PCSK9現(xiàn)貨供應(yīng)
隨著研究的不斷深入，PCSK9腺相關(guān)病毒注射配合高脂高膽固醇飲食，已經(jīng)逐漸成為動(dòng)脈粥樣硬化的理想造模方式。
維真生物擁有人源、鼠源過表達(dá)PCSK9腺相關(guān)病毒（AAV-PCSK9），供動(dòng)脈粥樣硬化研究者造模使用，現(xiàn)貨供應(yīng)，質(zhì)量有保證。 詳情垂詢【400-077-2566】 或添加【維真小助手微信號(hào)WZ4000772566】 咨詢。關(guān)注維真生物，讓維真產(chǎn)品助您科研一路順暢！
6. AAV-PCSK9參考文獻(xiàn)
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