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上述如此絢麗多彩的圖片是科學家采用2007年哈佛大學腦科學中心開發(fā)的Brainbow（彩虹腦）技術對小鼠海馬齒狀回DG進行多色標記的結(jié)果。
Brainbow是一項采用含多色熒光蛋白XFP的重組載體標記大腦的成像技術，其技術精髓就是XFP，技術核心是Cre/Loxp系統(tǒng)。具體來說，在Cre/Loxp系統(tǒng)的刪除或(和)顛倒作用下， 由單個啟動子在一種細胞群中驅(qū)動兩到四個XFP隨機表達；多個Brainbow轉(zhuǎn)基因拷貝的整合誘發(fā)這些XFP的組合表達，從而創(chuàng)造出更多的色彩。在神經(jīng)系統(tǒng)中，由此產(chǎn)生的多色標記可以用來區(qū)分相鄰的神經(jīng)元細胞或膠質(zhì)細胞，并在追蹤神經(jīng)環(huán)路的同時確定神經(jīng)元突起的身份，從而幫助科學家解析大腦。
那么，作為Brainbow技術精髓的XFP，大家又了解多少呢？這兩期推文我們將帶領大家深入、全面地了解熒光蛋白。
在正式介紹熒光蛋白之前，我們先來了解幾個光學基本概念：
我們在對樣品進行熒光成像時，首先樣品需要進行熒光標記，其次用某種波長的入射光進行照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光波長更長的發(fā)射光。在這過程中，用來標記樣品并使其具有發(fā)光性質(zhì)的物質(zhì)叫熒光物質(zhì)，而照射樣品的入射光叫激發(fā)光，發(fā)出來的發(fā)射光就叫熒光。
當熒光物質(zhì)被激發(fā)光照射后，激發(fā)光的能量就會供給熒光物質(zhì)，熒光物質(zhì)吸收能量后發(fā)生能級躍遷，即由低能級的基態(tài)躍遷至高能級的激發(fā)態(tài)。而高能級的激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，所以會恢復至低能級的基態(tài)。在這過程中，熒光物質(zhì)吸收的能量就會以光的形式進行釋放，從而產(chǎn)生熒光。而事實上，在能量釋放過程中還有一部分是被喪失掉的，因此發(fā)射光的能量低于激發(fā)光的能量，相對應地，發(fā)射光的波長要比激發(fā)光的波長長。熒光物質(zhì)發(fā)光的整個過程可用Jablonski能量圖來表示（圖1）。
熒光光譜分為激發(fā)光譜和發(fā)射光譜兩種：激發(fā)光譜是熒光物質(zhì)在不同波長的激發(fā)光作用下記錄的熒光強度隨激發(fā)光波長的變化情況；而發(fā)射光譜則是在固定波長的激發(fā)光作用下記錄的熒光強度隨發(fā)射光波長的變化情況。
無論是激發(fā)光譜還是發(fā)射光譜，記錄的均是熒光強調(diào)隨波長的變化情況，不同的是隨誰的波長而變化。電磁波波普將有助于我們了解各波普的波長，從而為我們設計實驗提供理論基礎（圖2）。
接下來我們就正式介紹熒光蛋白：
自1994年GFP首次被用于標記基因后，熒光蛋白（Fluorescent proteins，F(xiàn)Ps）就成了生命科學領域中非常重要的細胞成像工具之一。這些FPs借助高分辯率顯微技術能夠幫助我們觀察先前無法看到的生物過程，如活細胞內(nèi)的代謝過程、信號通路，大腦中的突觸鏈接，癌細胞的擴散等。
在1996年，GFP的晶體結(jié)構(gòu)被科學家成功解析：GFP是典型的β桶形結(jié)構(gòu)，包括11條β折疊和α螺旋：11條β折疊緊密交織在一起形成圓柱狀的“柵欄”，α螺旋上的第65、66、67位氨基酸（絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸）位于其正中位置，在分子氧的作用下，經(jīng)過環(huán)化、脫氫等作用最終形成成熟的熒光基團，嚴密的桶形結(jié)構(gòu)保護著熒光基團，防止它被周圍環(huán)境淬滅（圖3a和3b）；N端和C端均暴露在外面。
FPs的種類五花八門，就FPbase中收錄的就831種，幾乎覆蓋了從紫外光到遠紅外光的所有光譜波段。盡管這些FPs的光學特性大相徑庭，但是它們的結(jié)構(gòu)卻極其相似。結(jié)構(gòu)決定功能，人們對FPs結(jié)構(gòu)的深刻認識對于理解其功能及拓展其范圍具有非常重要的理論意義。
面對琳瑯滿目的FPs，研究人員在具體科學研究中往往受到一系列問題的困擾，如哪些FPs好用？哪些FPs亮度高？哪些因素影響理想FPs的選擇？下面我們就從如下幾方面一一展開討論，旨在為大家縮小選擇范圍提供參考。
FP的亮度由多種因素決定，包括FP固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數(shù)、量子產(chǎn)量和光穩(wěn)定性[長期實驗中]決定）、成像設備的光學特性（照射光的波長和強度，濾光片的光譜和二色鏡）和照相機或人眼對發(fā)射光譜的敏感性。雖然這些因素無法從整體上鑒定更亮的FP，但是在各個光譜波段內(nèi)還是有可能鑒定較亮的FP，因為這主要取決于其固有的光學特性。更亮的FP意味著可以用更低的激發(fā)光強度進行成像，從而更好地保護樣品免受光損傷。而且，更亮的FP可以提供檢測和成像所需的足夠信號。下表是各光譜波段推薦的FPs（表1）。
大多數(shù)FPs來源于海洋生物，而我們研究的基因大多數(shù)來自于哺乳動物。這兩種物種的密碼子偏好性存在較大差異，這種差異很可能會造成FP在哺乳動物表達系統(tǒng)中低表達甚至不表達，進而觀察不到熒光。因此，用于成像實驗的FPs往往都需要根據(jù)所表達系統(tǒng)進行密碼子優(yōu)化，使其能夠很好地表達。慶幸的是，目前我們所使用的FPs已針對哺乳動物的密碼子進行了優(yōu)化，而且可以很好地表達。FPs需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊、熒光基團形成等步驟形成成熟蛋白后才能發(fā)光。雖然，大多數(shù)經(jīng)過密碼子優(yōu)化的FPs能在哺乳動物系統(tǒng)中很好地表達，但是其折疊效率有快有慢，從而決定了其成熟時間不同。因此，F(xiàn)Ps的成熟時間也需考慮在內(nèi)，在進行目標蛋白亞細胞定位時，我們需要根據(jù)其壽命選擇相應的FP。
所有FPs最終都會在長時間的激發(fā)光照射下發(fā)生光漂白，從而逐漸喪失發(fā)光能力，但是其光漂白速率迥異。因此，針對不同的成像實驗，我們需要選擇不同光穩(wěn)定性的FP：對于需要不多于10張圖片的短期成像實驗，光穩(wěn)定性通常不是一個主要考慮因素，但在需要大量圖片的長期成像實驗中，選擇極具光穩(wěn)定性的FP是實驗成功的關鍵。
對于蛋白亞細胞定位實驗，我們在構(gòu)建熒光融合蛋白時要選擇單體性質(zhì)的FPs，因為多聚體的FPs很可能會能影響目標蛋白的功能或定位。
大多數(shù)FPs具有不同程度的酸敏感性，有的適合在酸性環(huán)境下使用，有的適合在堿性環(huán)境下使用，因此，在不同酸堿度溶液成像中，我們選擇FPs時還需考慮其PK 值（用于指示FPs的pH敏感性，PK 值越小酸性越強）。在特定條件下，那些對pH敏感的FPs可以指示細胞內(nèi)酸堿度的變化，例如單標（GFP-LC3B）和雙標（mCherry-GFP-LC3B）自噬指示系統(tǒng)就是利用了GFP和mCherry不同的酸敏感性來追蹤自噬流的。
自GFP被首次用于標記基因后，水母來源的GFP不斷被改造，得到了大量藍色、青色和黃色的衍生物。同時，來自其他物種的FPs也被陸續(xù)鑒定，進一步將FPs的顏色拓展至橙色、紅色和紅外光譜區(qū)。從FPs被改造的整個過程，我們可以看出，F(xiàn)Ps的改造趨向紅移。因為FPs越紅越好，顏色越紅意味著波長越長，對應的激發(fā)光波長也更長，長波長光的激發(fā)對細胞和組織的光損傷小，且背景自發(fā)熒光和動物組織的光吸收都非常小，組織穿透力強（圖4）。這些特征使得紅色FPs更適合于體內(nèi)深組織成像。
這些五顏六色的FPs為我們選擇FPs進行多色標記實驗提供了豐富的資源。值得注意的是，在選擇FPs顏色的同時還要兼顧它們的兼容性：一個好的經(jīng)驗法則是，兩種FPs的峰激發(fā)波長和峰值發(fā)射波長均應相隔50-60nm。
選擇FPs進行成像實驗時，所選FPs的光譜范圍需滿足實驗室現(xiàn)有成像設備的需求，畢竟重新購買成像設備成本還是比較高的。推薦使用的成像設備濾光片組合見表2。
本期先為大家介紹到這里，下一期我們?yōu)榇蠹医榻B熒光蛋白的應用，敬請期待。
1. Day, R. N. and M. W. Davidson (2009). "The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging." Chem Soc Rev 38(10): 2887-2921.
2. Shaner, N. C., et al. (2005). "A guide to choosing fluorescent proteins." Nat Methods 2(12): 905-909.
3. Keereweer, S., et al. (2013). "Optical image-guided cancer surgery: challenges and limitations." Clin Cancer Res 19(14): 3745-3754.
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