Brainbow為何如此絢爛多彩？探究成像背后熒光蛋白的奧秘（下）
探究成像背后熒光蛋白的奧秘
圖片來源于：Hippocampus, By Tamily Weissman, Harvard University
上期我們帶大家全面深入地了解了熒光蛋白，本期我們將和大家一起學(xué)習(xí)熒光蛋白的具體應(yīng)用。
1.熒光蛋白的應(yīng)用
如今，F(xiàn)Ps作為標(biāo)記蛋白和報(bào)告蛋白被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，以研究生命系統(tǒng)的組織和功能（圖1）。
圖1：FPs的主要應(yīng)用領(lǐng)域
①標(biāo)記蛋白
作為標(biāo)記蛋白，構(gòu)建熒光融合蛋白(Fluorescent Fusion Protein, FFP)可以用于研究蛋白定位，追蹤其動(dòng)態(tài)變化，追溯其歷史和研究蛋白之間的相互作用。那么，如何構(gòu)建FFP呢？在設(shè)計(jì)FFP時(shí)，我們需要考慮多方面的因素，如FFP的預(yù)期用途，選擇哪種FP，插入位置等等。隨著FPs的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展，很多熒光蛋白載體可通過商業(yè)化公司獲得?？v觀這些載體，F(xiàn)P通常位于多克隆位點(diǎn)附近（即目標(biāo)蛋白的N端或C端，圖2）。在根據(jù)上述FP選擇指南選定載體后，我們僅需通過簡單的亞克隆技術(shù)將目標(biāo)蛋白克隆至多克隆位點(diǎn)區(qū)即可。當(dāng)FP位于目標(biāo)蛋白C端時(shí)，為了確保兩者的正確折疊和功能，一段由2-10個(gè)氨基酸組成的鏈接序列（GS間隔，linker）往往是有用的。
圖2a：Clontech pEGFP-C1載體信息
圖2b：Clontech pEGFP-N1載體信息
但是，在許多情況下，我們需要根據(jù)目標(biāo)蛋白的實(shí)際情況修飾FFP，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白和膜蛋白：一個(gè)典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白通常含有兩段關(guān)鍵序列（信號(hào)序列，SS；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列，KDEL），若其功能域靠近C端，F(xiàn)P應(yīng)置于SS下游2-10個(gè)氨基酸處，這樣可以提高SS的切割效率，并有利于FFP的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)易位；若其功能域靠近N端，F(xiàn)P應(yīng)插入KDEL之前；對(duì)于單次跨膜蛋白，F(xiàn)P不能置于跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)內(nèi)/附近，因?yàn)檫@將破壞結(jié)構(gòu)域并導(dǎo)致膜整合的問題；對(duì)于多次跨膜蛋白，除了單次跨膜蛋白的不適位置外，F(xiàn)P也不可置于TMDs之間的環(huán)內(nèi)，因?yàn)門MDs之間的精確間距對(duì)于其正確折疊非常重要，且這些環(huán)通常包含功能域（圖3）。另外，還有些目標(biāo)蛋白在成熟過程中會(huì)切掉一段，如自噬標(biāo)志物L(fēng)C3。
圖3：FFP中FP的理想插入位置
（Chudakov, D. M., et al. (2010). Physiol Rev 90(3): 1103-1163.）
總之，不管如何構(gòu)建FFP，我們均需要確保FFP的序列正確，并通過實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其是否發(fā)光，其定位模式是否與目標(biāo)蛋白的類似，是否保留有目標(biāo)蛋白的功能等等。
②報(bào)告蛋白
作為報(bào)告蛋白，F(xiàn)Ps借助極具市場(chǎng)前景的AAV病毒載體被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究的各個(gè)階段，包括神經(jīng)標(biāo)記，基因操作，生理操縱和生理觀察。下面我們僅列舉幾個(gè)例子說明：
案例1： FPs用于標(biāo)記全腦和局部腦區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞（圖4）
圖4a：較AAV9，1×10E11vg AAV-PHP.eB-tdTomato高效標(biāo)記C57BL/6J小鼠的全腦神經(jīng)細(xì)胞，而不標(biāo)記B6C3小鼠
（Mathiesen, S. N., et al. (2020). Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.）
圖4b：1.5-2ul AAV5-hSyn-EGFP標(biāo)記海馬腹側(cè)下托神經(jīng)元（圖片來源于客戶）
圖4c：2ul AAV5-hSyn-mCherry標(biāo)記孤束核神經(jīng)元（圖片來源于客戶）
案例2： 添加靶序列和滯留序列的FPs用于標(biāo)記亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和追蹤其動(dòng)態(tài)變化（圖5）
圖5：Ach3.0質(zhì)粒和帶亞細(xì)胞標(biāo)記物的mScarlet共轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞的熒光圖片
2.結(jié)語
隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的FPs被開發(fā)并應(yīng)用。因此，科研人對(duì)于FPs可以說是眾所周知。盡管目前已有的FPs為科研人的各種成像實(shí)驗(yàn)帶來了眾多選擇。但是，隨著研究的深入，科研人對(duì)于成像實(shí)驗(yàn)提出了更高的需求，尤其在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)縱橫交錯(cuò)的神經(jīng)系統(tǒng)中體現(xiàn)地淋漓盡致。未來，亮度高、穩(wěn)定性高的單體FPs將可以進(jìn)行更密集的成像實(shí)驗(yàn)；高效折疊的單體光轉(zhuǎn)換FPs將提高我們光標(biāo)記融合蛋白的能力，F(xiàn)Ps光譜的長波長端將繼續(xù)拓寬，使科研人能夠在深組織和整個(gè)動(dòng)物中進(jìn)行更靈敏、更高效的成像實(shí)驗(yàn)。
3. 參考文獻(xiàn)
1. Chudakov, D. M., et al. (2010). "Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues." Physiol Rev 90(3): 1103-1163.
2. Mathiesen, S. N., et al. (2020). "CNS Transduction Benefits of AAV-PHP.eB over AAV9 Are Dependent on Administration Route and Mouse Strain." Mol Ther Methods Clin Dev 19: 447-458.
3. Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.
