更多AAV血清型被開發(fā)，組織特異性研究再添新選擇！
SARS-CoV-2假病毒
維真生物基于全面的病毒包裝平臺和穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝，將Monkeypox Virus （MPV）特異性靶標序列F3L和包膜蛋白B6R的基因序列，分別克隆構(gòu)建至慢病毒，腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）載體上，成功開發(fā)出高質(zhì)量的猴痘假病毒系列產(chǎn)品，并且具有良好的生物安全性和穩(wěn)定性。
腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV） 憑借高組織特異性、低免疫原性、高安全性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，已成為基因遞送的理想工具。AAV血清型眾多，不同血清型有著不同的組織嗜性，為科研和臨床提供多樣化的選擇。然而天然的AAV通常特異性不夠，而且機體通常對這些天然AAV存在先天免疫甚至抗體，這樣一來可能會干擾病毒與細胞的相互作用，影響科研及基因治療的結(jié)果。因此，獲取更強組織靶向性的AAV血清型，已成為科學(xué)家們探索和開發(fā)的方向。
一、AAV.CAP-B10：高效靶向神經(jīng)元細胞
大腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）的重要組成部分，很多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥和帕金森病等都與大腦組織的病變密切相關(guān)，以大腦為靶點的基因療法逐漸成為了當(dāng)今神經(jīng)疾病研究的熱點。天然AAV血清型傾向于靶向非CNS的器官或組織，尤其是肝臟。肝臟是一個具有免疫活性的器官，AAV靶向這些組織會引發(fā)免疫反應(yīng)，降低系統(tǒng)注射AAV的安全性和有效性。同時由于血腦屏障的存在，天然AAV血清型在大腦中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也受到嚴重限制。
加州理工學(xué)院的 Viviana Gradinaru 團隊通過對AAV9進行衣殼改造，開發(fā)了一系列AAV變體，其中AAV.CAP-B10，靜脈注射后，不僅能夠突破血腦屏障，高效靶向神經(jīng)元細胞，同時不會在肝臟富集 。
圖1. AAV.CAP-B10高效靶向小鼠腦組織而非肝臟
啟動子：CAG； 實驗動物：雄性C57BL/6J小鼠；
注射方式：靜脈注射； 病毒用量：5×10E11VG/mice
（David Goertsen，et al.Nature Neuroscience，2022）
該研究團隊對比了不同AAV血清型通過靜脈注射在各組織器官中的遞送效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAV.CAP-B10表現(xiàn)出對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性，高度靶向神經(jīng)元細胞，對肝臟具有低靶向性，這一結(jié)果不僅在小鼠上得到了證實（圖1），在非人靈長類動物狨猴上也得到了證實（圖2）。這為腦研究工作者提供了新的工具策略，同時這也為腦部疾病提供了一種更安全、有效的治療選擇。
圖2.在狨猴中，AAV.CAP-B10特異性靶向神經(jīng)元
啟動子：CAG； 實驗動物：成年狨猴； 注射方式：靜脈注射； 病毒用量：7×10E13VG/KG
（David Goertsen，et al.Nature Neuroscience，2022）
二、rAAV11: 高效靶向星形膠質(zhì)細胞
星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)鍵反應(yīng)細胞，在脊髓損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。星形膠質(zhì)細胞功能障礙已被證實是腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的核心特征。
中科院徐富強團隊對一系列工具病毒進行改造和篩選，開發(fā)了一種新的高效逆行靶向投射神經(jīng)元的重組腺相關(guān)病毒rAAV11。研究發(fā)現(xiàn)，rAAV11可以高效逆行靶向投射神經(jīng)元 ，且不表現(xiàn)出順行跨突觸特征；rAAV11還具備優(yōu)秀的逆行標記效率 ，能示蹤rAAV2難以轉(zhuǎn)導(dǎo)的投射神經(jīng)元。值得注意的是，rAAV11可以高效且特異性靶向星形膠質(zhì)細胞 ，為星形膠質(zhì)細胞的研究提供了更加有力的病毒工具。
圖3. rAAV11靶向星形膠質(zhì)細胞
啟動子：GfaABC1D； 實驗動物：C57BL/6J小鼠； 注射部位：齒狀回(DG)區(qū)； 病毒用量：2×10E9VG/mice
（Han et al.bioRxiv preprint, 2022）
三、AAV-cMG & AAV-MG：高效靶向小膠質(zhì)細胞
小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細胞，能協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)并動態(tài)塑造中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)回路。小膠質(zhì)細胞功能障礙和基因突變是許多CNS疾病的直接原因：絕大多數(shù)神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險基因都在小膠質(zhì)細胞中特異性表達或高表達；小膠質(zhì)細胞吞噬、激活或免疫調(diào)節(jié)功能的基因突變也會導(dǎo)致嚴重的CNS病變。
北京生命科學(xué)研究所羅敏敏實驗室通過定向進化策略，開發(fā)了一系列能夠在體內(nèi)和體外高效侵染小膠質(zhì)細胞的新型rAAV載體。該研究針對AAV9的衣殼蛋白進行改造，鑒定篩選出兩個衣殼蛋白（AAV-cMG.WPP和AAV-cMG.QRP）能夠在一定程度上提高rAAV病毒對體外培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細胞的侵染效率。以此為基礎(chǔ)，研究團隊針對AAV-cMG.QRP的插入肽段及其在衣殼蛋白插入位點的相鄰氨基酸進行突變篩選，成功得到了高效侵染體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞的AAV-cMG 衣殼蛋白，同時并不導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞的激活。
圖4. 體外篩選得到AAV-cMG
啟動子：CMV； 轉(zhuǎn)染細胞：小膠質(zhì)細胞；MOI：10E4
（Lin et al.Nature Neuroscience, 2022）
研究人員進一步在AAV-cMG.WPP基礎(chǔ)之上構(gòu)建新的AAV突變文庫，并在小膠質(zhì)細胞特異的Cx3cr1-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)進行針對性體內(nèi)篩選，成功鑒定得到AAV-MG1.1和AAV-MG1.2，能夠在體內(nèi)高效侵染小膠質(zhì)細胞 ，且不誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞免疫激活。
圖5. 體內(nèi)篩選得到AAV-MG1.1/1.2高效轉(zhuǎn)導(dǎo)小膠質(zhì)細胞
啟動子：CMV； 實驗動物：Cx3cr1-CreER轉(zhuǎn)基因小鼠；
注射部位：紋狀體（800nl）和中腦（500nl）； 病毒滴度：5×10E7 vg/μl
（Lin et al.Nature Neuroscience, 2022）
這兩類分別適用于體外侵染培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞（AAV-cMG）和體內(nèi)侵染內(nèi)源性小膠質(zhì)細胞（AAV-MG）的新型rAAV載體 ，將有助于小膠質(zhì)細胞生物學(xué)及相關(guān)疾病機制的研究。
四、AAV-BI30：高效靶向中樞血管內(nèi)皮細胞
腦血管內(nèi)皮細胞是表達在血管腔隙的一類中樞非神經(jīng)元細胞群體，作為血腦屏障的重要組成部分，參與許多關(guān)鍵的生理過程。此外，內(nèi)皮細胞在神經(jīng)系統(tǒng)功能中起著至關(guān)重要的作用，越來越多的證據(jù)表明內(nèi)皮細胞損傷是導(dǎo)致各類神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要原因。研究表明CNS內(nèi)皮細胞有著高度特異的分子功能：動脈內(nèi)皮細胞在血液流動與神經(jīng)活動的動態(tài)耦合中發(fā)揮關(guān)鍵作用，毛細血管內(nèi)皮細胞抑制胞運以保持血腦屏障的完整性，而靜脈內(nèi)皮細胞與神經(jīng)免疫交叉密切相關(guān)。
美國麻省理工學(xué)院-哈佛大學(xué)布羅德研究所的Benjamin E. Deverman組和哈佛醫(yī)學(xué)院的Chenghua Gu組開發(fā)了一種新的血清型AAV-BI30，可在多個鼠系體內(nèi)以及體外高效轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細胞 。在相對較低的全身劑量下，該載體可轉(zhuǎn)導(dǎo)成年C57BL/6小鼠大腦、視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)中的大多數(shù)動脈、毛細血管和靜脈內(nèi)皮細胞。
圖6. AAV-BI30能有效地通過動靜脈軸轉(zhuǎn)導(dǎo)大腦內(nèi)皮細胞
啟動子：CAG； 實驗動物：成年C57BL/6J小鼠；
注射方式：靜脈注射； 病毒用量：1×10E11 vg/mice
（Krolak et al.NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH, 2022）
圖7. AAV-BI30靶向視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞
啟動子：CAG； 實驗動物：成年C57BL/6J小鼠； 注射方式：靜脈注射； 病毒用量：1×10E11 vg/mice
（Krolak et al.NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH, 2022）
此外，AAV-BI30在CNS中能實現(xiàn)高效的Cre介導(dǎo)的基因操縱。AAV-BI30能高效的在中樞不同類型血管內(nèi)皮細胞中特異性表達 ，適用于神經(jīng)血管生物學(xué)相關(guān)研究，并有助于開發(fā)內(nèi)皮功能障礙類疾病的治療方法。
五、AAV9-RGDLRVS：高效靶向外周內(nèi)皮細胞
內(nèi)皮細胞在血管疾病的病理進展中發(fā)揮著重要作用，一旦內(nèi)皮細胞出現(xiàn)功能障礙，就會導(dǎo)致諸如高血壓、動脈粥樣硬化以及心血管疾病等。對內(nèi)皮細胞進行高效持久的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對于內(nèi)皮細胞功能的研究至關(guān)重要。
研究者在rAAV9衣殼A589位點插入七肽進行文庫構(gòu)建，篩選了得到兩種插入肽載體AAV9-RGDLRVS和AAV9-SLRSPPS，以流式篩選熒光確認感染效率。數(shù)據(jù)顯示，兩種插入肽的rAAV9載體對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞（HCAEC）、人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）、肝腎等來源的永生化細胞（HEK293T，HeLa，911，HepG2）的感染效率顯著高于天然AAV9載體。與天然AAV9載體相比，AAV9-RGDLRVS內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率提高了40倍。 此外，AAV9-SLRSPPS在人臍靜脈內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高。
圖8. AAV9-SLRSPPS和AAV9-RGDLRVS的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率
啟動子：CMV； MOI：2.5×10E3； 轉(zhuǎn)染時間：48h
（Varadi et al.Gene Therapy, 2012）
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