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1. AAV 和重組rAAV的區(qū)別？

腺相關(guān)病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。1965年，AAV發(fā)現(xiàn)于腺病毒制備物中，并由此得名。AAV是一種復(fù)制缺陷性病毒，其復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復(fù)制過程依賴于宿主細(xì)胞的聚合酶活性。

重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒有編碼AAV病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復(fù)制和包裝相關(guān)的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因表達(dá)框，這使rAAV具有約4.7 kb的包裝容量。

2. 使用AAV有哪些生物安全性要求 ?

可在生物安全1級(jí)（BSL-1）實(shí)驗(yàn)室操作生產(chǎn)無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應(yīng)在生物安全2級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室封閉處理具有生物危害性的材料。

3. 重組AAV 安全嗎 ?

迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。

4. 重組AAVs的克隆容量有多大?

AAV具有?4.7Kb的包裝能力。2個(gè)ITR之間插入的DNA長度接近允許的最大值4.7Kb時(shí)，包裝效率顯著降低。例如，對(duì)于過表達(dá)來自cDNA的基因，CMV-poly（A）信號(hào)元件約為1KB，因此最大可包裝的cDNA長度約為3.2kb，如果共表達(dá)GFP（約0.8kb），則可包裝的容量大約為2.4kb。

5. 哪些血清型的AAV可供選擇？

目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8 &，AAV9，AAV rh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等。

6. 使用重組腺相關(guān)病毒rAAV遞送基因的優(yōu)勢(shì)是什么 ?

rAAV病毒滴度高，可感染分裂和非分裂細(xì)胞、免疫原性小、體內(nèi)表達(dá)外源基因時(shí)間長。

7. AAV載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體 ?

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。

8. 訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? 客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的 ?

您可以從我們的人源ORF cDNA庫中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標(biāo)簽和AAV血清型。

基因沉默服務(wù)，請(qǐng)您提供已驗(yàn)證的shRNA序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標(biāo)準(zhǔn)載體具有U6啟動(dòng)子和GFP標(biāo)記。

通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^13 VP/ml。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定規(guī)格的產(chǎn)品。

9. 慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒三種病毒有什么區(qū)別？如何選擇？

對(duì)于轉(zhuǎn)染困難的細(xì)胞，科研工作者通常會(huì)選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實(shí)驗(yàn)體系的病毒工具，請(qǐng)參考下面3種病毒工具的比較：

1. 您好，我感染的細(xì)胞是滋養(yǎng)層細(xì)胞，感染之前在六孔板中接種十萬細(xì)胞，貼壁16h后加加入病毒（MOI=40），30h后細(xì)胞長滿。我想咨詢：病毒感染后實(shí)驗(yàn)組跟對(duì)照組相比細(xì)胞生產(chǎn)差不多，正常嗎？

如果感染腺病毒的細(xì)胞狀態(tài)與未感染組的細(xì)胞狀態(tài)無明顯差異，說明該病毒對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性作用。因此，未必是病毒數(shù)量不夠。非腺病毒包裝細(xì)胞被腺病毒感染后是不會(huì)有什么明顯的特征。如果您在加入病毒的時(shí)候是提前把病毒用培養(yǎng)基稀釋混勻之后再加入培養(yǎng)皿中的，那么高M(jìn)OI值（導(dǎo)致細(xì)胞飄起來）對(duì)于目的細(xì)胞是比較高的。因此，您不用擔(dān)心，可以先檢測一下是否有蛋白表達(dá)。

2. 腺病毒感染細(xì)胞后是否需要更換新鮮培養(yǎng)液？

是否需要更換新鮮培養(yǎng)液需要看加入病毒的量，病毒量多的時(shí)候會(huì)對(duì)細(xì)胞有毒性：如果鏡檢時(shí)看到細(xì)胞狀態(tài)有變化，需要在4-8h左右更換新鮮培養(yǎng)液；如果鏡檢時(shí)看到細(xì)胞狀態(tài)無明顯變化，那么病毒感染細(xì)胞之后就無需更換新鮮培養(yǎng)液?；蛘?，如果您擔(dān)心病毒長時(shí)間作用于細(xì)胞會(huì)有毒性，也可在12h后更換新鮮培養(yǎng)液。

3. 腺病毒感染細(xì)胞4-6h之后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全部飄起來了，請(qǐng)問這是怎么回事？

造成上述現(xiàn)象的原因主要有三點(diǎn)：

1）細(xì)胞的狀態(tài)：感染之前鋪板的細(xì)胞一定要使用健康的細(xì)胞；

2）實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)：在加入病毒液的時(shí)候，如果局部病毒濃度過高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，我們建議將病毒和培養(yǎng)基混勻之后再加入細(xì)胞中。

3）如果以上2點(diǎn)均無誤，那就是加入的病毒量太大了。

4. 腺病毒感染細(xì)胞時(shí)，加入病毒量的依據(jù)是什么？

要得到最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定腺病毒的最適用量是關(guān)鍵。量不足達(dá)不到100%感染效率；量太高則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。那么如何確定呢？"感染復(fù)數(shù)"(MOI，multiplicity of infection)起著決定作用。MOI是是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。不同細(xì)胞系細(xì)胞表面的腺病毒受體數(shù)量不同，這就決定了不同細(xì)胞系的MOI會(huì)有所不同。通常，易感染細(xì)胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是，對(duì)于某些難感染的細(xì)胞系，MOI可能需要高達(dá)1000。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系來說，最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻(xiàn)或者在正式實(shí)驗(yàn)前，在目的細(xì)胞中用報(bào)告基因的腺病毒進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸最佳MOI。

最適病毒用量的計(jì)算公式：
病毒用量pfu=最佳MOI×細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度
例如, 如果您目的細(xì)胞的最佳MOI=10，您需要感染106的細(xì)胞，那么您共計(jì)需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度為1×10¹⁰ pfu/mL, 那么您實(shí)驗(yàn)需要的病毒量就是1ul.

5. 腺病毒感染細(xì)胞之后多久可以從基因水平和蛋白水平檢測表達(dá)？如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時(shí)間是否有區(qū)別？

腺病毒攜帶的目的基因表達(dá)快。如果您想從基因水平檢測基因的表達(dá)，那么在病毒感染細(xì)胞12-24h之間進(jìn)行檢測；如果您想從蛋白水平檢測基因的表達(dá)，那么在病毒感染細(xì)胞48-72h之間進(jìn)行檢測。

對(duì)于分泌性蛋白和非分泌性蛋白，檢測時(shí)間一樣。如果擔(dān)心蛋白分泌出來，也可以將培養(yǎng)基也一起帶著做western blot。

6. 腺病毒毒種被細(xì)菌污染了，沒有多余毒種，也沒有構(gòu)建好的載體，怎么辦？

因?yàn)橄俨《镜闹睆酱笮∈?0-100nm，而細(xì)菌的直徑大小要大的多，可以用22um的濾器進(jìn)行過慮。如果您的病毒量很低，擔(dān)心過慮后損失太多，無法進(jìn)行后面的擴(kuò)增工作，您可以先用污染了細(xì)菌的腺病毒直接擴(kuò)增，當(dāng)然擴(kuò)增的結(jié)果是得到了污染了細(xì)菌的腺病毒，但病毒的量會(huì)提高一些，這樣再用22um的濾器進(jìn)行過濾。

7. 如何鑒定腺病毒遞送的目的基因？

可以按照如下方法進(jìn)行鑒定：

①針對(duì)基因設(shè)計(jì)引物，同時(shí)作為擴(kuò)增和測序引物；

②將病毒用蛋白酶K處理后做為模板，如果是未純化的病毒還需要過純化柱處理掉培養(yǎng)基的成分；

③以處理過的病毒為模板進(jìn)行PCR；

④用PCR引物對(duì)PCR產(chǎn)物測序。

8. 慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒三種病毒有什么區(qū)別？如何選擇？

對(duì)于轉(zhuǎn)染困難的細(xì)胞，科研工作者通常會(huì)選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實(shí)驗(yàn)體系的病毒工具，請(qǐng)參考下面3種病毒工具的比較：

1、什么情況下選用慢病毒？

慢病毒的宿主范圍比較廣，既能感染分裂細(xì)胞，也能感染非分裂的細(xì)胞，在體內(nèi)外研究中均可選擇慢病毒作為病毒載體。此外，慢病毒也是構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的理想病毒。

2、慢病毒載體可插入多大的 ORF 片段？

一般情況下，慢病毒載體可容納8 kb插入片段。然而，插入的ORF基因大于4 kb時(shí)會(huì)大大降低病毒的包裝效率，進(jìn)而影響病毒滴度甚至基因表達(dá)。

3、用于慢病毒感染的細(xì)胞接種量是多少？

將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到24孔板，細(xì)胞濃度一般為1×10⁵/mL細(xì)胞，接種細(xì)胞數(shù)量需要考慮到細(xì)胞活力因素、狀態(tài)因素、生長快慢因素、分裂因素等，一般是保證病毒感染時(shí)細(xì)胞匯合率達(dá)到50%-70%為佳。

4、什么是 MOI ？

MOI （multiplicity of infection），即感染復(fù)數(shù)，指的是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。一般認(rèn)為MOI是一個(gè)比值，沒有單位。

5、慢病毒是否能夠穩(wěn)定表達(dá)基因？

是的。慢病毒能將外源基因整合到宿主基因組中，不會(huì)隨著細(xì)胞分裂傳代而丟失，因此能實(shí)現(xiàn)外源基因的長期穩(wěn)定表達(dá)。

6、維真慢病毒的包裝周期是多久？

如果客戶提供構(gòu)建好的慢病毒載體，那么包裝時(shí)間一般為2周左右，若包含前期載體構(gòu)建等的時(shí)間，時(shí)間大概在5周左右。

7、慢病毒感染細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)什么時(shí)間達(dá)到峰值？

慢病毒感染目的細(xì)胞后，一般情況下，在72-96h目的基因的表達(dá)能達(dá)到峰值，但是對(duì)于一些特殊細(xì)胞、如增殖傳代比較慢的細(xì)胞，蛋白表達(dá)達(dá)到峰值則需要更長的時(shí)間。

8、怎樣提高慢病毒的感染效率？

細(xì)胞良好的生長狀態(tài)和感染時(shí)適合的 MOI 值是達(dá)到高感染效率的保證。一般可以通過提高感染時(shí)的 MOI 值來提高病毒的感染效率，必要時(shí)可在感染時(shí)加入助感染試劑ADV-HR來提高慢病毒的感染效率。

9、慢病毒感染后，細(xì)胞狀態(tài)很差，甚至出現(xiàn)死亡，為什么？

慢病毒會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的毒性，不同細(xì)胞對(duì)毒性的耐受力不同。建議調(diào)整并降低感染時(shí)使用的MOI值，即可在細(xì)胞準(zhǔn)備時(shí)增加鋪板細(xì)胞的匯合率（可提高至 70%），調(diào)整感染時(shí)加入的病毒量。此外，還可選擇在感染4小時(shí)后換液，用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察。

10、慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒三種病毒有什么區(qū)別？如何選擇？

對(duì)于轉(zhuǎn)染困難的細(xì)胞，科研工作者通常會(huì)選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前，腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實(shí)驗(yàn)體系的病毒工具，請(qǐng)參考下面3種病毒工具的比較：