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科訊前沿：南加利福尼亞大學(xué)張礪教授團(tuán)隊(duì)在AAV1順向跨單級(jí)突觸研究領(lǐng)域發(fā)表新成果！

大腦是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最高級(jí)的部分，是思維的器官，是心智和意識(shí)的物質(zhì)本體，也是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、功能最完善的器官，其對(duì)生命之重毋庸置言。雖然近幾十年神經(jīng)科學(xué)得到了快速的發(fā)展，然而，時(shí)至今日大腦仍屬于人類知之甚少的人體構(gòu)造之一。

背景介紹

腦行使功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是神經(jīng)環(huán)路，那么如何解析大腦不同腦區(qū)、不同類型神經(jīng)元之間神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)和功能呢？神經(jīng)示蹤技術(shù)是帶領(lǐng)我們探索大腦功能的工具之一。傳統(tǒng)的神經(jīng)示蹤技術(shù)存在諸多缺點(diǎn)，如無法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性標(biāo)記、無法攜帶基因、信號(hào)衰減等。作為新興神經(jīng)示蹤工具的病毒載體為這些問題的解決提供了新方案，是目前最為有效、應(yīng)用最廣的示蹤工具?；谑缮窠?jīng)病毒發(fā)展來的狂犬病毒(RV)和偽狂犬病毒(PRV)是成熟的、廣泛使用的跨突觸逆向病毒示蹤劑；而基于噬神經(jīng)病毒發(fā)展來的單純皰疹病毒(HSV)和水皰性口炎病毒(VSV)可以實(shí)現(xiàn)跨突觸順向標(biāo)記，但是其神經(jīng)毒性和跨突觸不可控，限制了其在解析神經(jīng)環(huán)路研究中的應(yīng)用，因此，這迫切需要我們尋找一種優(yōu)良的跨突觸順向病毒示蹤劑。

除噬神經(jīng)病毒外，AAV近年也被用于環(huán)路示蹤，因?yàn)锳AV具有復(fù)制缺陷性和極低的免疫原性，不會(huì)造成大量的神經(jīng)毒性。大部分的研究使用AAV進(jìn)行非跨突觸標(biāo)記。2014 Castle等人發(fā)現(xiàn)AAV1可順向示蹤神經(jīng)元，但是其潛在跨突觸的證據(jù)還不清楚并存在爭(zhēng)議。直到2017年，南加利福尼亞大學(xué)的 張礪教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)在《Neuron》發(fā)表的“AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors”，首次證實(shí)了AAV可順向跨單級(jí)突觸傳導(dǎo)，研究表明高滴度的AAV2/1-hSyn-Cre能有效、特異跨單級(jí)突觸標(biāo)記神經(jīng)元及其輸出，這為利用順向跨突觸病毒工具研究大腦復(fù)雜功能提供了可能性。

今天小V和大家分享AAV順向跨突觸傳導(dǎo)的最新研究成果。

2020年4月，張礪教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)又在《The Journal of Neuroscience》發(fā)表題為“Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry”的論文，深入研究了AAV病毒順向跨突觸傳導(dǎo)的突觸特異性和在多種神經(jīng)環(huán)路中的廣泛應(yīng)用。

研究結(jié)果

1. Zingg et al從解剖結(jié)構(gòu)、功能及分子方面全面探究AAV順向跨神經(jīng)元傳導(dǎo)的突觸特異性。

解剖結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果如下圖：在Ai14 x GAD67-GFP 小鼠的腦橋核PN和下橄欖核IO分別注射scAAV1-hSyn-Cre，發(fā)現(xiàn)小鼠的來自PN的投射標(biāo)記出小腦大量的顆粒細(xì)胞GCs，而小鼠的來自IO的投射標(biāo)記出小腦中的浦肯野細(xì)胞PCs，從而證實(shí)了AAV順向跨突觸傳導(dǎo)可特異性標(biāo)記突觸后的細(xì)胞群。

進(jìn)一步研究了AAV順向跨突觸傳導(dǎo)的突觸特異性的功能特征(見下圖)。將scAAV1-hSyn-Cre和AAV1-EF1a-DIO-ChR2-YFP 1:1混合注射入Ai14 小鼠初級(jí)視覺皮層V1，只有共轉(zhuǎn)這2種病毒的神經(jīng)元才能表達(dá)ChR2，采用全細(xì)胞記錄技術(shù)，藍(lán)光誘發(fā)突觸前神經(jīng)元興奮，產(chǎn)生動(dòng)作電位，動(dòng)作電位傳導(dǎo)到突觸后神經(jīng)元也可以產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，發(fā)現(xiàn)其功能性連接的下丘神經(jīng)元IC被標(biāo)記，且在TTX和4-AP存在的時(shí)候沒有變化。證明AAV1更傾向于標(biāo)記注射點(diǎn)下游突觸連接的神經(jīng)元。

作者探究了AAV1從突觸末端釋放的機(jī)理（見下圖）。將AAVDJ-CMV-TeNT-P2A-GFP ( AAV1-hSyn-GFP 作為對(duì)照) 注射入Ai14小鼠的初級(jí)視覺皮層V1。14天后在同一腦區(qū)注射入scAAV1-hSyn-Cre，并在2周后檢測(cè)上丘SC中 tdTomato+細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果顯示：TeNT組跨突觸標(biāo)記tdTomato +細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組減少約94%。TeNT可通過切割VAMP2從而完全阻斷Ca2+誘發(fā)的突觸囊泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而證實(shí)了AAV的傳導(dǎo)明顯依賴于突觸囊泡的釋放。

2. 在抑制性、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和腦-脊髓投射多種神經(jīng)環(huán)路中AAV順向跨突觸傳導(dǎo)的能力。

抑制性神經(jīng)環(huán)路中的研究結(jié)果見下圖。將scAAV1 - hSyn - Cre注射到紋狀體Str中，Str中含有GABA能棘狀神經(jīng)元，它可以投射到黑質(zhì)網(wǎng)狀核SNr中的抑制性細(xì)胞。14天后，發(fā)現(xiàn)SNr中的神經(jīng)元被標(biāo)記；此外，作者還測(cè)試了AAV1從SNr中的抑制性神經(jīng)元擴(kuò)散到丘腦腹內(nèi)側(cè)核VM中的興奮性神經(jīng)元的概率，發(fā)現(xiàn)VM中也有相當(dāng)數(shù)量的神經(jīng)元被標(biāo)記，證明AAV1可以用于抑制性神經(jīng)元投射順向跨突觸標(biāo)記不同類型的多種細(xì)胞。

神經(jīng)調(diào)質(zhì)神經(jīng)環(huán)路中的研究結(jié)果見下圖。將scAAV1-hSyn-Cre注射入Ai14 小鼠斜帶核NDB、背側(cè)中縫核DR和藍(lán)斑LC中，14天后，發(fā)現(xiàn)其投射的下游腦區(qū)神經(jīng)元被稀疏或者零標(biāo)記。證明AAV1順向跨突觸標(biāo)記能力在神經(jīng)調(diào)質(zhì)能的神經(jīng)環(huán)路中的應(yīng)用比較局限：在谷氨酸和γ氨基丁酸神經(jīng)環(huán)路中，AAV1具有高效的順向跨突觸標(biāo)記能力；而乙酰膽堿、五羥色胺和去甲腎上腺素神經(jīng)環(huán)路中則顯得極其遜色。

腦-脊髓投射神經(jīng)環(huán)路中的研究結(jié)果見下圖。將scAAV1-hSyn-Cre注射入Ai14 小鼠的初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層Mop-II、初級(jí)軀體感覺皮層SSP-II、外側(cè)下丘腦LHA、紅核RN中，14天后，發(fā)現(xiàn)脊髓頸椎、胸椎和腰椎處神經(jīng)元被不同程度標(biāo)記，證明AAV1在腦-脊髓投射神經(jīng)環(huán)路中具有順向跨突觸標(biāo)記能力，為進(jìn)一步研究腦-脊髓投射神經(jīng)環(huán)路功能奠定了基礎(chǔ)。

研究結(jié)論

通過比較不同AAV血清型和嗜神經(jīng)病毒，發(fā)現(xiàn)AAV1具有順向跨突觸標(biāo)記能力，然而AAV1的順向跨突觸標(biāo)記能力非常弱，需要聯(lián)合重組酶系統(tǒng)(如Cre or Flp)進(jìn)行放大，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)基因的強(qiáng)表達(dá)。相比AAV1-hSyn-Cre，scAAV1-hSyn-Cre表現(xiàn)出了更優(yōu)越的順向跨突觸標(biāo)記能力：本研究從解剖、功能和分子層面深入研究了AAV1順向跨突觸傳導(dǎo)的突觸特異性，并闡述了其作用機(jī)制整體上依賴于突觸囊泡的釋放；scAAV1-hSyn-Cre可在興奮性、抑制性、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和腦-脊髓等多種神經(jīng)環(huán)路中有效、特異地標(biāo)記單突觸靶神經(jīng)元及其輸出，從而解析不同的功能/行為?？傊?，scAAV1-hSyn-Cre具有有效、特異跨突觸標(biāo)記能力，鑒于其同時(shí)具有低概率的逆向示蹤能力，它僅適用于精確標(biāo)記單向神經(jīng)環(huán)路，通過與其它技術(shù)(如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和稀疏標(biāo)記等)的聯(lián)合運(yùn)用可以滿足神經(jīng)研究人員的多種實(shí)驗(yàn)需求。

本文獻(xiàn)中的部分AAV病毒由維真生物提供，如下表所示：

下表所示為維真生物多種AAV產(chǎn)品，如有需要，歡迎致電400-077-2566！

Reference

1. Castle MJ, Gershenson ZT, Giles AR, Holzbaur ELF, Wolfe JH (2014a) Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Hum Gene Ther 25:705-720.

2. Zingg B, Chou X, Zhang Z, Mesik L, Liang F, Tao HW, Zhang LI (2017) AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocol-licular input-defined neural pathways for defense behaviors. Neuron 93:33-47.

3. Brian Zingg, Bo Peng, Junxiang Huang, Huizhong W. Tao, and Li I. Zhang(2020) Synaptic Specificity and Application of Anterograde Transsynaptic AAV for Probing Neural Circuitry. The Journal of Neuroscience 40 (16): 3250-3267.