《Science》北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越中心徐敏課題組合作揭示：基底前腦谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)控睡眠穩(wěn)態(tài)因子腺苷
《Science》北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越中心徐敏課題組合作揭示：基底前腦谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)控睡眠穩(wěn)態(tài)因子腺苷
背景介紹
睡眠是生命所需。人一生中有將近1/3的時(shí)間處于睡眠狀態(tài)。睡眠質(zhì)量的好壞與人體健康密切相關(guān)。睡眠障礙會(huì)引起負(fù)面情緒，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)重大精神疾病。但是人為什么需要睡眠？熬夜后為什么睡得更沉、更香？睡眠到底是如何被調(diào)控的呢？一系列科學(xué)問題尚待解決。
人體內(nèi)有兩大系統(tǒng)會(huì)引發(fā)睡意：睡眠穩(wěn)態(tài)與晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律是通過內(nèi)在的生物鐘控制一天中睡眠覺醒的時(shí)間；睡眠穩(wěn)態(tài)則主要是由睡眠壓力進(jìn)行調(diào)控，睡眠壓力的累計(jì)程度控制機(jī)體的睡眠量。先前研究已鑒定了許多睡眠穩(wěn)態(tài)因子和生物學(xué)過程。其中，基底前腦（basal forebrain，BF）腺苷的釋放是睡眠穩(wěn)態(tài)的重要生理調(diào)節(jié)因子。腦內(nèi)與睡眠覺醒相關(guān)的神經(jīng)核團(tuán)有很多，BF是調(diào)控該周期的一個(gè)重要核團(tuán)。BF內(nèi)含有膽堿能、谷氨酸能和GABA能多種類型神經(jīng)元，這些神經(jīng)元活動(dòng)如何調(diào)控腺苷的釋放仍是一個(gè)謎。
近日，北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越創(chuàng)新中心徐敏課題組合作在《Science》發(fā)表了題為《Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons》的研究論文。該項(xiàng)研究利用新型遺傳編碼的高靈敏性、高特異性和高時(shí)間分辨率的腺苷探針，聯(lián)合運(yùn)用光纖記錄、光遺傳學(xué)和細(xì)胞特異損毀技術(shù)揭示了BF谷氨酸能神經(jīng)元在調(diào)控腺苷動(dòng)態(tài)變化和睡眠穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，進(jìn)一步闡明了睡眠穩(wěn)態(tài)調(diào)控的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制，為探索睡眠障礙的治療方法提供了重要參考。
部分研究結(jié)果
01
新型遺傳編碼腺苷探針的開發(fā)和特征描述
為了高特異性和高時(shí)間分辨率檢測(cè)睡眠覺醒周期中BF胞外腺苷濃度的動(dòng)態(tài)變化，李毓龍教授組開發(fā)了腺苷探針（GRABAdo），該探針的檢測(cè)原理是基于腺苷G蛋白偶聯(lián)受體的激活，使胞外腺苷的濃度通過綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度來測(cè)量。作者從靈敏性、特異性和胞內(nèi)信號(hào)通路的偶聯(lián)等方面分別進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)迭代優(yōu)化后的GRABAdo1.0（簡(jiǎn)稱Ado1.0）具有較高的靈敏性和特異性，同時(shí)與胞內(nèi)信號(hào)通路具有微乎其微的偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞生理無明顯影響（圖1）。
圖1. 基因編碼腺苷探針的設(shè)計(jì)與特征
02
睡眠覺醒周期中胞外腺苷的動(dòng)態(tài)變化
據(jù)睡眠中腦電圖表現(xiàn)、眼球運(yùn)動(dòng)情況和肌張力變化，睡眠可分為非快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠 (NREMS)和快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠(REMS)兩種時(shí)相。其中，REMS由于持續(xù)時(shí)間短，傳統(tǒng)的微透析無法記錄腺苷濃度的變化。腺苷探針的高時(shí)間分辨率使問題得到了有效解決。作者使用AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0-mScarlet和AAV2/9-hsyn-GRABAdo-mut腦立體定位注射小鼠BF并測(cè)量熒光信號(hào)。為了排除運(yùn)動(dòng)噪音，作者將Ado1.0與紅色熒光蛋白mScarlet融合表達(dá)，該紅色熒光蛋白對(duì)腺苷濃度的變化不敏感。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：小鼠BF胞外腺苷濃度的變化順序?yàn)椋嚎焖傺蹌?dòng)睡眠階段>覺醒階段>非快速眼動(dòng)睡眠階段(后2個(gè)階段的結(jié)果跟傳統(tǒng)微透析的結(jié)果一致)。而且，當(dāng)小鼠在這三種狀態(tài)間轉(zhuǎn)換時(shí)，腺苷濃度的變化相對(duì)較快。胞外腺苷濃度的快速變化揭示其釋放可能依賴于神經(jīng)活動(dòng)（圖2）。
圖2. 小鼠基底前腦在睡眠覺醒周期中的腺苷動(dòng)力學(xué)檢測(cè)
03
睡眠覺醒周期小鼠基底前腦膽堿能神經(jīng)元對(duì)腺苷濃度變化的調(diào)節(jié)
先前已有研究表明，BF膽堿能神經(jīng)元（ChAT+）和谷氨酸能神經(jīng)元（VGLUT2+）在覺醒和REMS階段非?；钴S，而且利用光遺傳學(xué)技術(shù)激活這兩類神經(jīng)元可以促進(jìn)機(jī)體覺醒。因此，作者首先通過檢測(cè)ChAT+神經(jīng)元活動(dòng)與胞外腺苷濃度變化的相關(guān)性研究了BF ChAT+神經(jīng)元的作用。作者利用“兩側(cè)雙探針”法將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAV2/9-EF1α-DIO-GCaMP6s分別注入ChAT-Cre小鼠大腦半球兩側(cè)BF，2周后測(cè)定熒光信號(hào)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ChAT+神經(jīng)元鈣活動(dòng)與胞外腺苷濃度的變化高度相關(guān)，且鈣活動(dòng)通常早于腺苷信號(hào)變化~24 s，表明BF ChAT+神經(jīng)元可能調(diào)控胞外腺苷的濃度變化。
接著，作者將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAV2/9-hSyn-FLEX-ChrimsonR-tdTomato 混合注射ChAT-Cre小鼠BF，光遺傳激活ChAT+神經(jīng)元，利用光纖記錄腺苷的釋放量。ChAT+神經(jīng)元的激活引起胞外腺苷小幅顯著增加，表明ChAT+神經(jīng)元可調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化。但是，誘發(fā)腺苷濃度變化的幅度在不同試驗(yàn)中有較大差異，表明BF中可能存在其它類型神經(jīng)細(xì)胞調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化（圖3）。
圖3. BF膽堿能神經(jīng)元中的鈣活動(dòng)與胞外腺苷濃度變化相關(guān)
04
睡眠覺醒周期小鼠基底前腦谷氨酸能神經(jīng)元對(duì)腺苷濃度變化的調(diào)節(jié)
隨后，作者采用同樣的“兩側(cè)雙探針”法又進(jìn)一步研究了BF VGLUT2+神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，BF VGLUT2+神經(jīng)元中的鈣活動(dòng)與胞外腺苷濃度變化高度相關(guān)，且早于腺苷信號(hào)~41s。光遺傳激活VGLUT2+神經(jīng)元可引起胞外腺苷濃度大幅增加，并且高于激活ChAT+神經(jīng)元所引起的胞外腺苷濃度，這表明VGLUT2+神經(jīng)元對(duì)調(diào)節(jié)睡眠覺醒周期中胞外腺苷濃度的變化貢獻(xiàn)更大。
接下來，作者用Caspase-3特異損毀BF VGLUT2+神經(jīng)元，測(cè)量腺苷濃度的變化。將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAVDJ-flex-taCasp3-TEVp混合注射VGLUT2-Cre小鼠BF，兩周后觀察到BF VGLUT2+神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠BF胞外腺苷濃度的增加在覺醒和REM階段顯著減少。上述結(jié)果進(jìn)一步證明BF VGLUT2+神經(jīng)元對(duì)胞外腺苷濃度增加起重要調(diào)節(jié)作用（圖4）。
圖4. 睡眠覺醒周期中，BF VGLUT2+神經(jīng)元有助于胞外腺苷濃度的增加
05
BF谷氨酸能神經(jīng)元的損毀會(huì)破壞睡眠穩(wěn)態(tài)
最后，作者通過細(xì)胞特異性損毀驗(yàn)證了BF中VGLUT2+神經(jīng)元的缺失會(huì)影響小鼠睡眠穩(wěn)態(tài)。與對(duì)照組相比，BF VGLUT2+神經(jīng)元缺失的小鼠在覺醒狀態(tài)下的時(shí)間明顯更長(zhǎng)，且這種差異主要表現(xiàn)為小鼠在夜晚清醒度增加。
作者又檢測(cè)了BF VGLUT2+神經(jīng)元的缺失是否會(huì)影響睡眠恢復(fù)。亮燈6h使老鼠保持清醒狀態(tài)，隨后18h內(nèi)進(jìn)行恢復(fù)性睡眠。實(shí)驗(yàn)組小鼠NREM睡眠明顯減少，并且NREM睡眠時(shí)間下降速度明顯加快。上述結(jié)果表明BF VGLUT2+神經(jīng)元的缺失影響了小鼠的睡眠穩(wěn)態(tài)（圖5）。
圖5. BF谷氨酸能神經(jīng)元的損毀會(huì)破壞睡眠穩(wěn)態(tài)
小結(jié)
此研究中，作者開發(fā)了一種新型的高靈敏度、高特異性和高時(shí)間分辨率的腺苷探針（GRABAdo），通過結(jié)合光遺傳學(xué)操作和細(xì)胞特異損毀技術(shù)，闡明了睡眠覺醒周期中小鼠基底前腦谷氨酸能神經(jīng)元調(diào)節(jié)胞外腺苷濃度變化，積累睡眠壓力，從而對(duì)睡眠穩(wěn)態(tài)具有重要調(diào)節(jié)作用。該研究為機(jī)體在清醒狀態(tài)下神經(jīng)活動(dòng)通過刺激促眠因子的釋放而增加睡眠壓力的機(jī)制提供了新的見解。
原文鏈接：https://science.sciencemag.org/content/369/6508/eabb0556
維真生物助力病毒及用法
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AAV病毒
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AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0-mScarlet; AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0 ; AAV2/9-hsyn-GRABAdo-mut;
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注射動(dòng)物
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7周齡以上雄性和雌性小鼠
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注射體積
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0.2 ~ 0.4 μl
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注射方式
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腦立體定位注射
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注射位置
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基底前腦
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檢測(cè)時(shí)間
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2周
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李毓龍教授組其他神經(jīng)遞質(zhì)探針（部分）
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探針類別
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病毒名稱
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膽堿類
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乙酰膽堿探針
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AAV9-hSyn-GACh2.0
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AAV9-TRE-GACh2.0
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AAV9-hSyn-ACh3.0(ACh4.3)
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AAV9-CaMKII-ACh3.0(ACh4.3)
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AAV9-GfaABC1D-ACh3.0(ACh4.3)
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……
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嘌呤類
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腺苷探針
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AAV9-hsyn-Ado1.0(B10)
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AAV DJ-hsyn-Ado1.0(B10)
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AAV9-EFS-DIO-Ado1.0
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AAV9-GfaABC1D-Ado1.0
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AAV9-hsyn-Ado1.0mut(B10-F168A)
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……
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腺苷三磷酸探針
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AAV9-hsyn-ATP1.0(B09)
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AAV DJ-hsyn-ATP1.0
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AAV9-EFS-DIO-ATP1.0
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AAV9-GfaABC1D-ATP1.0
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AAV9-hsyn-ATP1.0mut(B09 N283A)
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……
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生物胺類
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多巴胺探針
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AAV9-hSyn-DA1h(DA4.2)
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AAV9-hSyn-DIO-DA1h(DA4.2)
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AAV9-hSyn-DA1hmut(DA4.2mut)
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AAV9-TRE-DA1hmut(DA4.2mut)
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AAV9-CaMKII-DA1h(DA4.2)
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……
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五羥色胺探針
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AAV9-hsyn-r5HT1.0
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AAV9-CAG-r5HT1.0
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AAV9-hsyn-r5HT2.0
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AAV9-hsyn-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0)
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AAV9-hsyn-DIO-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0)
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……
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組胺探針
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AAV9-hsyn-HA1.0h (His1.0)
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AAV9-hsyn-HA1.0mut (His1.0mut)
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AAV9-hsyn-HA1.0m (His1.0M)
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AAV9-hsyn-DIO-HA1.0h
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AAV9-hsyn-HA1.0h-mScarlet
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……
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去甲腎上腺素探針
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AAV9-hsyn-NE1m(NE2.1)
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AAV9-hSyn-DIO-NE1m(NE2.1)
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AAV9-hSyn-NEmut(NE2.1mut)
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AAV9-TRE-NE1m(NE2.1)
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AAV9-hsyn-mRuby3-NE1m(NE2.1)
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……
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神經(jīng)肽類
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血管活性腸肽探針
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AAV9-hsyn-VIP1.0
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AAV9-hsyn-DIO-VIP1.0
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……
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神經(jīng)肽Y探針
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AAV9-hsyn-NPY1.0
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AAV9-EF1a-DIO-NPY1.0
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……
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神經(jīng)降壓肽探針
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AAV9-hsyn-NTS1.0
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……
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膽囊收縮素
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AAV9-hsyn-CCK2.0
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AAV1-hsyn-CCK2.0
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AAV9-hsyn-DIO-CCK2.0
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……
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促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素探針
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AAV9-hSyn-CRF3.0
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AAV9-EFS-DIO-CRF3.0
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AAV9-CaMKII-CRF3.0
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AAV9-hSyn-CRFmut
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AAV9-EFS-DIO-CRFmut
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……
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精氨酸血管加壓素探針
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AAV9-hsyn-AVP2.0
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AAV9-hsyn-DIO-AVP2.0
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……
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催產(chǎn)素探針
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AAV9-hSyn-OXT1.0
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AAV9-EFS-DIO-OXT1.0
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AAV9-hSyn-OXTmut
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AAV9-EFS-DIO-OXTmut
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……
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生長(zhǎng)激素抑制素探針
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AAV9-hsyn-SST2.0
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AAV9-hsyn-DIO-SST2.0
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……
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其他
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大麻素AEA探針
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AAV9-hsyn-AEA1.0
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……
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內(nèi)源性大麻素eCB探針
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AAV9-hsyn-eCB2.0
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AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0
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AAV9-hsyn-eCB2.0mut
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AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0mut
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AAV9-GfaABC1D-eCB2.0
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……
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褪黑素探針
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AAV9-hsyn-MT2.0
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……
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以上探針均由維真生物協(xié)助提供，其中已發(fā)表的探針（藍(lán)色標(biāo)注），點(diǎn)進(jìn)進(jìn)入了解更多探針詳情。歡迎大家點(diǎn)擊“AAV工具” 中的“神經(jīng)遞質(zhì)探針”進(jìn)行選購(gòu)??！如若您對(duì)探針序列或者未發(fā)表的探針感興趣，請(qǐng)您聯(lián)系北京大學(xué)李毓龍課題組（yulonglilab2018@gmail.com）。
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