《Cell》‖ 浙江大學(xué)靳津和東南大學(xué)柴人杰研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合發(fā)文:應(yīng)激反應(yīng)致外周CD4+ T細(xì)胞代謝紊亂誘發(fā)焦慮行為
無(wú)標(biāo)題文檔
應(yīng)激反應(yīng)是各種緊張性刺激物引起的個(gè)體非特異性反應(yīng)，包括生理反應(yīng)和心理反應(yīng)兩大類。生理反應(yīng)表現(xiàn)為交感神經(jīng)興奮、垂體和腎上腺皮質(zhì)激素分泌增多、血糖升高、血壓上升、心率加快等；心理反應(yīng)包括情緒反應(yīng)與自我防御反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起外周T淋巴細(xì)胞功能紊亂，腦神經(jīng)可塑性的變化，增加抑郁和焦慮的風(fēng)險(xiǎn)。T淋巴細(xì)胞在情感障礙疾患中的調(diào)節(jié)機(jī)制和病理性作用是怎樣的呢？浙江大學(xué)靳津和東南大學(xué)柴人杰研究團(tuán)隊(duì)使用維真生物AAV-shRNA產(chǎn)品在《Cell》（IF=38.637）雜志聯(lián)合發(fā)表“Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior”的研究論文，文章揭示了CD4+ T細(xì)胞嘌呤代謝紊亂與應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮行為之間的關(guān)聯(lián)。
研究結(jié)果
1. CD4+ T細(xì)胞在應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮行為中起重要的作用
作者通過足部電擊 (electronic foot shock，ES)野生型（WT）和Rag1-/- （免疫缺陷）小鼠誘發(fā)焦慮模型，開場(chǎng)試驗(yàn)（Open Field Test，OFT）發(fā)現(xiàn)，Rag1-/-小鼠對(duì)中心區(qū)域探索和運(yùn)動(dòng)的興趣沒有降低，與研究報(bào)道急性ES小鼠的外周血管CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增加結(jié)果一致，表明焦慮發(fā)生的起始階段免疫系統(tǒng)會(huì)適應(yīng)性的改變。
通過靜脈注射中和抗體來(lái)耗盡CD4+和CD8+細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)只有CD4+ T細(xì)胞的去除顯著逆轉(zhuǎn)了OFT和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（elevated plus-maze test，EPM）ES誘導(dǎo)的焦慮行為。CD4+ T細(xì)胞缺乏可以阻止急性束縛應(yīng)激（acute restraint stress，RS）引起小鼠產(chǎn)生焦慮。上述結(jié)果表明CD4+ T細(xì)胞對(duì)物理應(yīng)激誘發(fā)的焦慮行為有著廣泛的影響。
為評(píng)價(jià)T細(xì)胞是否具有焦慮印跡保留作用，將NT小鼠和ES小鼠脾臟CD4+或CD8+ T細(xì)胞分別過繼轉(zhuǎn)移到Rag1-/- 小鼠，發(fā)現(xiàn)只有接受ES誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的Rag1-/-小鼠在OFT中產(chǎn)生焦慮行為，且初始CD4+ T細(xì)胞引發(fā)的焦慮程度要比效應(yīng)T細(xì)胞更嚴(yán)重。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1）
圖1 CD4+ T細(xì)胞在應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮行為中起重要作用
2. 應(yīng)激誘導(dǎo)外周血CD4+T細(xì)胞線粒體分裂
測(cè)序分析ES小鼠的CD4+和CD8+ T細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組，CD4+ T細(xì)胞中鑒定出128個(gè)特異性差異表達(dá)基因(DEGs)，基因本體分析顯示大多數(shù)DEGs編碼線粒體蛋白質(zhì)。胞外酸化速率（extracellular acidification rate, ECAR）和耗氧速率（axygen consumption rate, OCR）測(cè)定顯示，ES和RS小鼠初始CD4+ T細(xì)胞的糖酵解和氧化磷酸化水平均顯著下降，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能受到影響。通過共聚焦顯微成像和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ES初始CD4+ T細(xì)胞的線粒體呈點(diǎn)狀，線粒體融合的外膜蛋白MFN2和MIGA2顯著減少，表明CD4+ T細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下表現(xiàn)為線粒體形態(tài)異常和代謝功能障礙。
研究發(fā)現(xiàn)白三烯B4（LTB4）給藥會(huì)使小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的焦慮行為，去除CD4+ T細(xì)胞后焦慮行為消失。體外實(shí)驗(yàn)顯示在應(yīng)激反應(yīng)中LTB4顯著增加線粒體分裂，降低了MFN2和MIGA2在初始CD4 + T細(xì)胞中的表達(dá)。研究證明應(yīng)激反應(yīng)可誘導(dǎo)LTB4啟動(dòng)外周血CD4+ T細(xì)胞線粒體的裂變，并引發(fā)焦慮。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2）
圖2 應(yīng)激導(dǎo)致CD4+ T細(xì)胞代謝紊亂和線粒體裂變
為了確定T細(xì)胞線粒體形態(tài)與焦慮行為的關(guān)系，作者建立了Miga2-/-小鼠，OFT、EPM、暗-光轉(zhuǎn)換和懸尾實(shí)驗(yàn)中，Miga2-/-小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的抑郁癥狀，并在初始CD4+ T中觀察到了高度破碎的線粒體。為了進(jìn)一步闡明外周血CD4+ T細(xì)胞線粒體分裂的特殊功能，作者生成了Miga2 T細(xì)胞條件敲除(KO) (Miga2TKO)小鼠。缺乏Miga2的T細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)方面沒有表現(xiàn)出任何明顯的異常，但Miga2TKO小鼠仍然表現(xiàn)出類似于Miga2-/-小鼠的焦慮樣行為。Miga2TKO小鼠在連續(xù)EPM測(cè)試中表現(xiàn)出正常的恐懼記憶消失，說(shuō)明Miga2缺陷的CD4+ T細(xì)胞對(duì)正常的學(xué)習(xí)記憶沒有影響。為了消除Miga蛋白在焦慮中的特殊功能，作者又生成了Mfn1和Mfn2 T細(xì)胞條件下雙KO (Mfn1/ 2TKO)小鼠，T細(xì)胞中缺乏Mfn1/2的小鼠與野生型小鼠相比也表現(xiàn)出類似焦慮的行為，這表明焦慮行為是由線粒體形態(tài)紊亂引起的，而不是由某些線粒體蛋白的特定功能引起的。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3）
圖3 CD4+ T細(xì)胞線粒體的持續(xù)分裂導(dǎo)致產(chǎn)生焦慮行為
3. T細(xì)胞線粒體的持續(xù)裂變導(dǎo)致全身嘌呤代謝紊亂
聚類分析顯示Miga2TKO小鼠的代謝組學(xué)特征與同窩WT小鼠有顯著差異，代謝產(chǎn)物的差異主要集中于嘌呤代謝。Miga2TKO小鼠體內(nèi)嘌呤及其衍生物（腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤）的含量是同窩野生型小鼠的10-100倍。去除CD4+ T細(xì)胞后，Miga2TKO小鼠血清黃嘌呤濃度顯著降低。在兩種嚙齒動(dòng)物焦慮模型和過繼性轉(zhuǎn)移ES小鼠CD4+ T細(xì)胞的Rag1-/-小鼠血清中也觀察到黃嘌呤濃度明細(xì)增加。
WT小鼠體內(nèi)注射合成的黃嘌呤或腺苷發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤、腺嘌呤和單磷酸阿糖腺苷都能引發(fā)小鼠產(chǎn)生焦慮行為。BCX-1777（嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑）明顯降低Miga2TKO和ES小鼠的焦慮癥狀，同時(shí)顯著降低小鼠血清黃嘌呤的濃度。由此可知，病理性CD4+ T細(xì)胞引起的黃嘌呤過量在焦慮行為中起至關(guān)重要的作用。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4）
圖4 CD4+ T細(xì)胞線粒體的分裂導(dǎo)致血清嘌呤增加
4. 黃嘌呤直接作用于小鼠左側(cè)杏仁核的少突膠質(zhì)細(xì)胞
研究表明杏仁核在恐懼和持續(xù)焦慮的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用，左杏仁核與社交焦慮、強(qiáng)迫癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激以及焦慮有關(guān)。組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Miga2TKO小鼠左杏仁核比右杏仁核和WT小鼠杏仁核更大，非神經(jīng)元細(xì)胞的數(shù)量更多。經(jīng)黃嘌呤處理的小鼠左杏仁核表現(xiàn)出與Miga2TKO小鼠相似的病理表型。單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示，腺嘌呤和黃嘌呤發(fā)揮通過A1、A2A、A2B和A3四種受體亞型發(fā)揮各自的生理功能，且A1在少突膠質(zhì)細(xì)胞中大量表達(dá)。
作者分析了 WT、Miga2-/-、αCD4處理的Miga2-/-小鼠杏仁核中非神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。scRNA 序列和FACS分析顯示Miga2-/-小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞比例顯著增加，去除CD4+ T細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。BRdU摻入試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃嘌呤作為致病因素，可顯著增加少突膠質(zhì)細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞周期，直接誘發(fā)少突膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。已有資料表明黃嘌呤作用于A1受體并促進(jìn)蛋白激酶A (PKA)/ cAMP的活性。作者發(fā)現(xiàn)Miga2-/-小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞中PKA/ cAMP通路被明顯激活，耗盡CD4+T細(xì)胞可下調(diào)該通路。作為左側(cè)杏仁核少突膠質(zhì)細(xì)胞唯一可檢測(cè)到的腺苷受體A1，通過注射腺相關(guān)病毒AAV-MBP-shAdor1-GFP（維真生物提供）成功地特異性敲低A1受體，Miga2-/-小鼠不再表現(xiàn)出焦慮癥狀。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5）
圖5 CD4+ T細(xì)胞來(lái)源的黃嘌呤通過A1受體作用于左杏仁核的少突膠質(zhì)細(xì)胞
5. 線粒體裂變促進(jìn)CD4+ T細(xì)胞中黃嘌呤的合成
嘌呤有兩種合成途徑：從頭合成和回收。在從頭合成途徑中，葡萄糖代謝產(chǎn)物5-磷酸糖苷基-1-焦磷酸(PRPP)提供了形成嘌呤環(huán)的骨架結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)Miga2-/-和Mfn1/2TKO小鼠CD4+ T細(xì)胞氧化磷酸化和糖酵解活性顯著降低，但5-磷酸核糖（R-5-P）、CAIR、腺苷和肌苷則大量增加，表明線粒體在從融合到裂變過程中，葡萄糖通過磷酸戊糖途徑（PPP）重新合成嘌呤。2-脫氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解、PPP和嘌呤的合成）可使Miga2TKO小鼠的焦慮癥狀和左杏仁核病理特征恢復(fù)正常。
WT和Miga2-/-小鼠初始CD4+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析表明，Miga2-/-小鼠的 CD4 + T細(xì)胞與糖酵解和脂肪酸?氧化途徑相關(guān)的多個(gè)關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，但是嘌呤合成所需的分子：己糖激酶3 (Hk3)、腺苷脫氨酶(Ada)、嘌呤核苷磷酸化酶2 (Pnp2)和黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤脫氫酶(Xdh)有所增加。PNP催化肌苷和鳥苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤或鳥嘌呤。與PNP相似，PNP2也是一種調(diào)節(jié)嘌呤代謝途徑和黃嘌呤產(chǎn)生的酶，由于其在初始CD4+ T細(xì)胞中的低表達(dá)，認(rèn)為其缺乏可能不會(huì)像PNP缺乏那樣導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷。Pnp2-/-小鼠未表現(xiàn)出任何明顯的T淋巴細(xì)胞發(fā)育或成熟障礙，進(jìn)一步與Miga2-/-小鼠雜交產(chǎn)生Pnp2-/-/Miga2-/-小鼠，當(dāng)Pnp2-/-/Miga2-/-CD4+ T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)入Rag1-/-小鼠后，Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細(xì)胞不像Miga2-/- CD4+ T細(xì)胞那樣引起焦慮癥狀。由于Pnp2缺失不能完全阻斷黃嘌呤的合成，在移植Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細(xì)胞的Rag1-/- 小鼠血清中，黃嘌呤仍有適度升高。這些結(jié)果表明CD4+ T細(xì)胞來(lái)源的過量黃嘌呤可直接導(dǎo)致焦慮行為。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6）
圖6 CD4+ T細(xì)胞線粒體的裂變促進(jìn)嘌呤從頭合成途徑
干擾素調(diào)節(jié)因子-1（IRF-1）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞過程。作者發(fā)現(xiàn)Miga2-/-和ES小鼠CD4+T細(xì)胞中IRF-1顯著積累。染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)研究表明巨噬細(xì)胞IRF-1富集于Ada、Xdh和Pnp2的啟動(dòng)子區(qū)域。IRF-1缺乏使Miga2-/-小鼠CD4+ T細(xì)胞Ada和Xdh mRNA和蛋白水平恢復(fù)正?；?，減輕了Miga2TKO小鼠的焦慮行為。CD4+ T細(xì)胞中的IRF-1在線粒體裂變調(diào)節(jié)嘌呤合成并產(chǎn)生焦慮癥狀中起著至關(guān)重要的作用。（實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7）
圖7 IRF-1的積累促進(jìn)嘌呤合成和焦慮行為
結(jié)論
本研究揭示了外周血CD4+ T細(xì)胞來(lái)源的黃嘌呤和焦慮行為之間的重要聯(lián)系。如下：
小V相信AAV-shRNA相關(guān)產(chǎn)品將對(duì)各種精神和代謝疾病藥物的研發(fā)提供巨大幫助。
靳津教授 現(xiàn)擔(dān)任浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院教授，長(zhǎng)期從事非經(jīng)典NF-kB的調(diào)控機(jī)理，以及蛋白修飾在自主免疫性疾病發(fā)病過程中調(diào)控功能的研究，已在Nature等國(guó)際一流期刊發(fā)表研究論文30余篇。
柴人杰教授 現(xiàn)任東南大學(xué)生命科學(xué)研究院教授，近5年發(fā)表SCI論文72篇（總影響因子481.8）；長(zhǎng)期致力于神經(jīng)元和內(nèi)耳毛細(xì)胞的再生和保護(hù)以及神經(jīng)干細(xì)胞和內(nèi)耳干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究。
維真生物為本研究提供以下腺相關(guān)病毒載體：
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AAV9-GFAP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
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AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
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AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(scramble)
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維真生物shRNA干擾相關(guān)產(chǎn)品和服務(wù)
① 現(xiàn)有涵蓋27000余種人源基因的siRNAs序列；
② 可隨時(shí)將shRNAs克隆至腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒載體，制備病毒載體；
③ 此外，維真還可為您提供專屬的shRNA克隆服務(wù)和基因沉默效果檢測(cè)服務(wù)。
具體服務(wù)內(nèi)容如下：
shRNA克隆服務(wù):
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服務(wù)編號(hào)
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服務(wù)類型
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WZ030001
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單shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
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WZ030002
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套餐shRNA質(zhì)粒構(gòu)建(3保1)
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WZ030003
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套餐shRNA質(zhì)粒構(gòu)建(4保1)
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WZ030004
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2 in 1 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
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WZ030005
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3 in 1 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
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WZ030006
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4 in 1 shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
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WZ030007
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誘導(dǎo)性shRNA質(zhì)粒構(gòu)建(Dox、Cre……)
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WZ030008
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mir30-based shRNA質(zhì)粒構(gòu)建
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基因沉默效果檢測(cè)服務(wù):
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服務(wù)編號(hào)
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服務(wù)類型
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檢測(cè)方法
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WZ090001
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特異shRNA沉默效果檢測(cè)
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實(shí)時(shí)定量PCR推薦！Western blot
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WZ090002
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高效shRNA篩選
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實(shí)時(shí)定量PCR推薦！Western blot
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欲知更多服務(wù)詳情請(qǐng)致電400-077-2566。
