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稀疏標記技術—實現對單個神經元的重構

顧名思義，單細胞標記/稀疏標記技術就是對單個神經元進行明亮標記，從而實現在單神經元水平上解析大腦結構，繪制單神經元投射圖譜。

2. 為什么要對單個神經元進行標記？

以往的研究主要注重于描繪大腦中的不同腦區(qū)之間以及不同位置神經元類群之間的連接，雖然這些腦連接圖譜揭示了神經系統(tǒng)的基本結構，但由于缺乏單細胞精度，腦區(qū)水平或神經元類群水平的連接圖譜并不能準確反映神經系統(tǒng)的精細結構，因此闡明單個神經元的軸突和樹突投射模式已經成為探索大腦神經回路結構的關鍵，重建單個神經元不僅能幫助我們了解其在神經環(huán)路中的形態(tài)結構，還有助于精確解析有關神經信號如何組織及如何通過大腦傳遞到目標區(qū)域。

雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)是由北京生命科學研究所羅敏敏教授團隊和華中科技大學龔輝教授團隊合力開發(fā)的，這一基于腺相關病毒（AAV）載體的標記方法能夠以細胞類型和投射特異性對單個神經元進行強烈和稀疏標記。利用此系統(tǒng)，研究團隊實現了單神經元在全腦水平的完整重構，以及透明化腦片中間神經元的形態(tài)重構。這一技術的開發(fā)擴展了人們在單神經元水平上解析大腦結構的能力，并有助于在正常和病理條件下繪制單神經元投射圖譜。

①雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的設計原理
超新星（Supernova）載體通過tTA/TRE正反饋表達機制的泄露表達來稀疏和明亮地標記神經元，但缺乏細胞類型特異性，研究者在此基礎上進行改造，將一對正交重組酶（Cre/Flp）與tTA/TRE正反饋表達機制相結合。
改進的稀疏標記系統(tǒng)由兩個AAV載體組成：①控制子（controller）：包含一個TRE啟動子和一個編碼Flp重組酶 (FLPo，其中“o”表示優(yōu)化的版本)的Cre依賴的表達盒；②放大子（amplifier）：也使用TRE啟動子，但帶有一個編碼綠色熒光蛋白GFP和Tet轉錄激活因子tTA的Flp依賴的表達盒（圖1）。

圖1、雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的設計原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

②雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的工作原理
將兩種AAV載體混合后注射到表達Cre的小鼠腦區(qū)，當病毒感染Cre陽性神經元后，控制子中Cre依賴的轉錄元件會被翻轉。但由于此時神經元細胞中沒有表達tTA，TRE啟動子轉錄活性極低，無法驅動FLPo的強烈表達，也就不能觸發(fā)放大子中Flp依賴的轉錄元件的翻轉。由于TRE啟動子低水平的滲漏表達，極少數Cre陽性神經元中FLPo的表達量達到一定的水平，進而能觸發(fā)放大子載體上Flp依賴的轉錄元件的翻轉，從而表達微量的GFP和tTA。此時，僅極少數細胞內tTA的表達量達到一定水平，觸發(fā)了放大子中Flp依賴的轉錄元件的翻轉。然后tTA水平足以與TRE啟動子結合，激活控制子和放大子載體上的轉錄元件表達，由此啟動了一個正反饋循環(huán)，進一步提高了GFP的表達水平，標記強度得到增強（圖2）。

圖2、雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的工作原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

③雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的優(yōu)勢
1）由于標記的觸發(fā)依賴于Cre，通過將該稀疏標記系統(tǒng)與Cre轉基因小鼠聯(lián)用，可有效對大腦特定區(qū)域的特定類型的單個神經元進行稀疏、明亮地標記；
2）通過調整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標記的稀疏程度；
3）通過結合多種位點特異性重組酶可以建立更多版本，有望實現更復雜的表達策略；
4）理論上，該系統(tǒng)可以與光遺傳學、分子探針和基因編輯等元件聯(lián)用，用于單細胞水平功能性研究；
總而言之，雙AAV稀疏標記系統(tǒng)這一技術的開發(fā)將有助于將腦連接譜研究推向單細胞精度，并有希望幫助研究人員在單細胞精度下對正常及病理狀態(tài)的神經元進行研究。

④雙AAV載體稀疏標記系統(tǒng)的應用
借助雙AAV稀疏標記系統(tǒng)，研究者不僅可對中腦多巴胺神經元進行特異性標記，而且還可對單個神經元的特異性投射進行有效標記；此外，將該標記系統(tǒng)與熒光顯微光學切片斷層成像系統(tǒng)（fMOST）相結合，可建立一個包括細胞類型特異性稀疏標記、高分辨率全腦成像、形態(tài)學重建和定量分析的通道，在全腦水平上實現了進行定量單神經元重建的可能性。最后，將該稀疏標記系統(tǒng)與組織透明技術uDISCO結合使用，實現了對中間神經元的快速重構，并且可以高效地對神經元樹突的分支特征進行量化分析。詳情可下載原文進行查看：https://doi.org/10.1038/s41592-018-0184-y

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參考文獻：

[1].Chen, D., et al., A Whole-Brain Cell-Type-Specific Sparse Neuron Labeling Method and Its Application in a Shank3 Autistic Mouse Model. Front Cell Neurosci, 2020. 14: p. 145.

[2].Ibrahim, L.A., et al., Sparse Labeling and Neural Tracing in Brain Circuits by STARS Strategy: Revealing Morphological Development of Type II Spiral Ganglion Neurons. Cereb Cortex, 2019. 29(4): p. 1700.

[3].Lin, R., et al., Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods, 2018. 15(12): p. 1033-1036.

[4].Economo, M.N., et al., A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. Elife, 2016. 5: p. e10566.

[5].Kuhlman, S.J. and Z.J. Huang, High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in  mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PLoS One, 2008. 3(4): p. e2005.