稀疏標(biāo)記技術(shù)—實現(xiàn)對單個神經(jīng)元的重構(gòu)
1. 什么是單細胞標(biāo)記/稀疏標(biāo)記技術(shù)？
顧名思義，單細胞標(biāo)記/稀疏標(biāo)記技術(shù)就是對單個神經(jīng)元進行明亮標(biāo)記，從而實現(xiàn)在單神經(jīng)元水平上解析大腦結(jié)構(gòu)，繪制單神經(jīng)元投射圖譜。
2. 為什么要對單個神經(jīng)元進行標(biāo)記？
神經(jīng)系統(tǒng)的一個主要特征是存在大量具有不同形態(tài)、分子結(jié)構(gòu)和生理特性的神經(jīng)元，而神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單元，數(shù)十億個神經(jīng)元組成了至少1000種不同類型的神經(jīng)元。不同類型的神經(jīng)元在不同的大腦回路中扮演著不同的角色，它們整合到各種神經(jīng)環(huán)路中以執(zhí)行復(fù)雜的行為。神經(jīng)環(huán)路是大腦行使各項功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，繪制整個大腦的神經(jīng)環(huán)路圖譜是神經(jīng)生物學(xué)一個重要的研究課題，對于腦科學(xué)的研究及腦疾病的治療都具有非常重要的意義。
以往的研究主要注重于描繪大腦中的不同腦區(qū)之間以及不同位置神經(jīng)元類群之間的連接，雖然這些腦連接圖譜揭示了神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)，但由于缺乏單細胞精度，腦區(qū)水平或神經(jīng)元類群水平的連接圖譜并不能準確反映神經(jīng)系統(tǒng)的精細結(jié)構(gòu)，因此闡明單個神經(jīng)元的軸突和樹突投射模式已經(jīng)成為探索大腦神經(jīng)回路結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，重建單個神經(jīng)元不僅能幫助我們了解其在神經(jīng)環(huán)路中的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還有助于精確解析有關(guān)神經(jīng)信號如何組織及如何通過大腦傳遞到目標(biāo)區(qū)域。
3. 單細胞標(biāo)記/稀疏標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展？
在過去，高爾基染色法、生物胞素和熒光染料等示蹤劑的使用、細胞內(nèi)電生理記錄和單細胞RNA測序的結(jié)合等方法被廣泛應(yīng)用于不同類型的神經(jīng)元形態(tài)可視化，使我們對神經(jīng)元的樹突和軸突形態(tài)有了較為詳細的了解，也為神經(jīng)元的形態(tài)和電生理特性之間的關(guān)系提供了相當(dāng)多的信息。然而，這些方法很難針對特定的神經(jīng)元類型。單細胞標(biāo)記/稀疏標(biāo)記技術(shù)推動了單個神經(jīng)元重建工作的不斷前進。
細胞類型特異性基因工具通過在不同類型的細胞中靶向表達各種分子傳感器和探針，為研究大腦功能提供了強有力的方法。在小鼠中，Cre/Lox系統(tǒng)得到了廣泛的應(yīng)用，目前已有大量Cre驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因鼠系，與其他重組酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)相結(jié)合允許對特定細胞類型進行更精細和靈活的控制。病毒介導(dǎo)的基因傳遞也是標(biāo)記和操縱哺乳動物大腦神經(jīng)元的一種替代和強大的策略，它們可以對單個神經(jīng)元進行多拷貝轉(zhuǎn)染，并且使用了表達強且普遍存在的轉(zhuǎn)錄啟動子，通常可以實現(xiàn)高水平的基因表達，對神經(jīng)元突觸等精細結(jié)構(gòu)進行明亮標(biāo)記。其中，以重組腺相關(guān)病毒（rAAV）的應(yīng)用較為廣泛。
今天我們就為大家介紹一項基于AAV載體的單細胞標(biāo)記/稀疏標(biāo)記技術(shù)！
雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)
雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)是由北京生命科學(xué)研究所羅敏敏教授團隊和華中科技大學(xué)龔輝教授團隊合力開發(fā)的，這一基于腺相關(guān)病毒（AAV）載體的標(biāo)記方法能夠以細胞類型和投射特異性對單個神經(jīng)元進行強烈和稀疏標(biāo)記。利用此系統(tǒng)，研究團隊實現(xiàn)了單神經(jīng)元在全腦水平的完整重構(gòu)，以及透明化腦片中間神經(jīng)元的形態(tài)重構(gòu)。這一技術(shù)的開發(fā)擴展了人們在單神經(jīng)元水平上解析大腦結(jié)構(gòu)的能力，并有助于在正常和病理條件下繪制單神經(jīng)元投射圖譜。
①雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的設(shè)計原理
超新星（Supernova）載體通過tTA/TRE正反饋表達機制的泄露表達來稀疏和明亮地標(biāo)記神經(jīng)元，但缺乏細胞類型特異性，研究者在此基礎(chǔ)上進行改造，將一對正交重組酶（Cre/Flp）與tTA/TRE正反饋表達機制相結(jié)合。
改進的稀疏標(biāo)記系統(tǒng)由兩個AAV載體組成：①控制子（controller）：包含一個TRE啟動子和一個編碼Flp重組酶 (FLPo，其中“o”表示優(yōu)化的版本)的Cre依賴的表達盒；②放大子（amplifier）：也使用TRE啟動子，但帶有一個編碼綠色熒光蛋白GFP和Tet轉(zhuǎn)錄激活因子tTA的Flp依賴的表達盒（圖1）。
圖1、雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的設(shè)計原理
（Lin R., et al., Nat Methods, 2018.）
②雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的工作原理
將兩種AAV載體混合后注射到表達Cre的小鼠腦區(qū)，當(dāng)病毒感染Cre陽性神經(jīng)元后，控制子中Cre依賴的轉(zhuǎn)錄元件會被翻轉(zhuǎn)。但由于此時神經(jīng)元細胞中沒有表達tTA，TRE啟動子轉(zhuǎn)錄活性極低，無法驅(qū)動FLPo的強烈表達，也就不能觸發(fā)放大子中Flp依賴的轉(zhuǎn)錄元件的翻轉(zhuǎn)。由于TRE啟動子低水平的滲漏表達，極少數(shù)Cre陽性神經(jīng)元中FLPo的表達量達到一定的水平，進而能觸發(fā)放大子載體上Flp依賴的轉(zhuǎn)錄元件的翻轉(zhuǎn)，從而表達微量的GFP和tTA。此時，僅極少數(shù)細胞內(nèi)tTA的表達量達到一定水平，觸發(fā)了放大子中Flp依賴的轉(zhuǎn)錄元件的翻轉(zhuǎn)。然后tTA水平足以與TRE啟動子結(jié)合，激活控制子和放大子載體上的轉(zhuǎn)錄元件表達，由此啟動了一個正反饋循環(huán)，進一步提高了GFP的表達水平，標(biāo)記強度得到增強（圖2）。
圖2、雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的工作原理
（Lin R., et al., Nat Methods, 2018.）
③雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的優(yōu)勢
1）由于標(biāo)記的觸發(fā)依賴于Cre，通過將該稀疏標(biāo)記系統(tǒng)與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)用，可有效對大腦特定區(qū)域的特定類型的單個神經(jīng)元進行稀疏、明亮地標(biāo)記；
2）通過調(diào)整控制子和放大子的混合比例，能夠控制標(biāo)記的稀疏程度；
3）通過結(jié)合多種位點特異性重組酶可以建立更多版本，有望實現(xiàn)更復(fù)雜的表達策略；
4）理論上，該系統(tǒng)可以與光遺傳學(xué)、分子探針和基因編輯等元件聯(lián)用，用于單細胞水平功能性研究；
總而言之，雙AAV稀疏標(biāo)記系統(tǒng)這一技術(shù)的開發(fā)將有助于將腦連接譜研究推向單細胞精度，并有希望幫助研究人員在單細胞精度下對正常及病理狀態(tài)的神經(jīng)元進行研究。
④雙AAV載體稀疏標(biāo)記系統(tǒng)的應(yīng)用
借助雙AAV稀疏標(biāo)記系統(tǒng)，研究者不僅可對中腦多巴胺神經(jīng)元進行特異性標(biāo)記，而且還可對單個神經(jīng)元的特異性投射進行有效標(biāo)記；此外，將該標(biāo)記系統(tǒng)與熒光顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)（fMOST）相結(jié)合，可建立一個包括細胞類型特異性稀疏標(biāo)記、高分辨率全腦成像、形態(tài)學(xué)重建和定量分析的通道，在全腦水平上實現(xiàn)了進行定量單神經(jīng)元重建的可能性。最后，將該稀疏標(biāo)記系統(tǒng)與組織透明技術(shù)uDISCO結(jié)合使用，實現(xiàn)了對中間神經(jīng)元的快速重構(gòu)，并且可以高效地對神經(jīng)元樹突的分支特征進行量化分析。詳情可下載原文進行查看：https://doi.org/10.1038/s41592-018-0184-y
維真生物部分雙AAV稀疏標(biāo)記載體
維真生物擁有多種雙AAV稀疏標(biāo)記載體，可為您提供更高滴度和純度的AAV病毒，且具有多種熒光蛋白的放大子，為您的單神經(jīng)元稀疏標(biāo)記助一臂之力！
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載體名稱
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屬性
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pAV-Tre-DIO-FLP
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控制子
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pAV-Tre-fDIO-EGFP-IRES-TTA
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放大子
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pAV-Tre-fDIO-tdTomato-IRES-TTA
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放大子
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