AAV在腦組織中的靶向策略（干貨篇）
神經(jīng)系統(tǒng)分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system, CNS）和外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous system，PNS）。中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，分別位于顱腔和椎管內(nèi)，是神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，外周神經(jīng)系統(tǒng)包括與腦相連的腦神經(jīng)（cranial?nerves）和與脊髓相連的脊神經(jīng)（spinal?nerves）。隨著研究的深入，人們對神經(jīng)系統(tǒng)功能已經(jīng)有了更近一步的認識，但由于神經(jīng)系統(tǒng)的復雜性、組織再生能力的有限性以及血腦屏障對藥物傳送的阻隔，使用傳統(tǒng)藥物和外科手術(shù)方法治療神經(jīng)系統(tǒng)類疾病仍困難重重。
人腦解剖圖
目前，基因療法已被應用于多種疾病的治療，利用病毒載體將遺傳物質(zhì)傳遞到器官周圍，并在靶細胞中實現(xiàn)特異表達，進而實現(xiàn)基因治療。在神經(jīng)科學研究中，尤其是在體實驗，通常利用腺相關(guān)病毒工具載體研究基因的功能作用，那么如何才能更高效地利用AAV在神經(jīng)系統(tǒng)進行基因轉(zhuǎn)導呢？今天我們就一起學習AAV在神經(jīng)研究中的選擇策略。
一、AAV血清型的選擇
據(jù)報道，目前適用于神經(jīng)系統(tǒng)的AAV血清型有：1、2、5、6、8、9、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、DJ、Retro、rh10等十幾種，不同的血清型在神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的感染效率及擴散能力不同，合適的血清型關(guān)乎基因是否能夠?qū)崿F(xiàn)高效穩(wěn)定表達，甚至關(guān)乎最終的研究結(jié)果，因此綜合標記的細胞和每種AAV血清型的特性等因素來選擇合適的AAV血清型至關(guān)重要。根據(jù)文獻報道，AAV1,2和5在CNS轉(zhuǎn)導水平有限，且表現(xiàn)出不同的細胞特異性，如AAV1和5能轉(zhuǎn)導神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞，而AAV2只能轉(zhuǎn)導神經(jīng)元。AAV9在CNS中的應用則較為廣泛，具有強的擴散性，且能穿過血腦屏障（BBB）實現(xiàn)基因高表達。而在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，AAV9、rh10、PHP.S的感染效果較好。
接下來，就來詳細介紹一下在神經(jīng)環(huán)路示蹤中幾種常用的AAV血清型：
1、可逆向示蹤的血清型— AAV2-retro
常見的AAV病毒載體都是順向標記，極少能進行逆行傳遞，這大大限制了AAV載體在神經(jīng)環(huán)路示蹤中的應用。直到2016年，研究人員在AAV2的基礎(chǔ)上，通過定向進化的方式改造出一種具有逆向示蹤功能的AAV2突變體——AAV2-retro，該載體能夠在小鼠大腦中進行有效的神經(jīng)環(huán)路逆向標記，且其逆行示蹤能力和效率與傳統(tǒng)的逆行示蹤劑相當。圖2所示為rAAV2-retro的開發(fā)過程及應用實例：
rAAV2-retro（逆向非跨突觸標記）
（Tervo et al., Neuron, 2016）
2、可順向跨單級突觸的血清型 — AAV1
2017年張礪教授團隊研究報道AAV1能在高滴度條件下呈順向跨突觸傳播，與Cre依賴的報告系統(tǒng)相結(jié)合，可高效和特異性地驅(qū)動Cre依賴的外源基因在突觸后神經(jīng)元中的表達，以標記突觸后神經(jīng)元。2020年該研究團隊再次深入研究了AAV1順向跨突觸標記的作用機制——依賴于突觸囊泡的釋放，同時揭示了其在多種神經(jīng)環(huán)路中的廣泛應用，為AAV1作為順向跨突觸示蹤病毒工具對神經(jīng)元及其投射腦區(qū)進行標記提供了諸多證據(jù)，如圖3所示。
AAV1順向跨突觸標記
（Zingg B et al., J Neurosci, 2020）
此外，張礪教授團隊還證實scAAV1-hSyn-Cre相比AAV1載體具有更優(yōu)越的順向跨突觸標記能力，可在興奮性、抑制性、神經(jīng)調(diào)質(zhì)和腦-脊髓等多種神經(jīng)環(huán)路中有效、特異地標記單突觸靶神經(jīng)元及其輸出，從而解析不同的功能/行為。
3、可跨血腦屏障的血清型 — AAV9、AAVPHP.B、AAVPHP.eB、AAVPHP.S、AAV.CPP.16
血腦屏障的存在對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有很強的保護作用，但同時它也能阻隔藥物的傳遞和吸收，使神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療變得異常困難，研究人員通過進一步改造AAV衣殼，發(fā)現(xiàn)AAV9& AAVPHP.B&AAVPHP.eB&AAVPHP.S可以有效介導基因由外周向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越，繼而將遺傳物質(zhì)遞送至大腦或脊髓中。研究結(jié)果顯示，AAV-PHP.B可以有效地轉(zhuǎn)導成年小鼠大腦和脊髓的神經(jīng)元，AAV-PHP.eB降低了誘導大多數(shù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元所需的病毒載量，而AAV-PHP.S顯示出對周圍神經(jīng)元的更好趨向性?？傊@些AAV變體可以有效介導基因由外周向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越，更好地應用于神經(jīng)環(huán)路研究。
AAV9& AAVPHP.B& AAVPHP.eB& AAVPHP.S有效介導基因由外周至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的跨越
(Ken Y Chanet al., Nat Neurosci, 2017)
美國哈佛大學聯(lián)合武漢大學人民醫(yī)院研究團隊利用合理性設(shè)計的方法，將選定的細胞穿透肽 CPP（一 組可以穿過細胞膜或組織屏障的短肽）分別插入 AAV9 衣殼（Q588 和 A589 之間）生成突變體庫， 將包裝好的 AAV 突變體通過靜脈注射至小鼠體內(nèi)，經(jīng)過序列優(yōu)化和篩選測試，得到血腦屏障穿透性顯著優(yōu)于 AAV9 的 AAV.CPP.16。通過在不同品系小鼠和食蟹猴動物模型中進行驗證，發(fā)現(xiàn)靜脈注射AAV.CPP.16 可以高效跨越血腦屏障，感染 CNS 神經(jīng)元細胞、星形膠質(zhì)細胞以及脊髓運動神經(jīng)元。基于小鼠與食蟹猴研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)給藥 AAV.CPP.16 仍可感染肝臟、肌肉、心臟等外周臟器，但在檢查的組織中均未觀察到明顯的病理反應，也未引起背根神經(jīng)節(jié)退化變性。重要的是，研究人員發(fā)現(xiàn)AAV.CPP.16 可用于 GBM 小鼠模型的基因治療，并具有持久高效的抗腫瘤作用。
AAV.CPP.16 對食蟹猴的腦部轉(zhuǎn)導效率顯著優(yōu)于AAV9
啟動子：CAG 實驗動物：新生食蟹猴(3 月齡)/ 成年食蟹猴(3-4 歲)
注射方式：靜脈注射 病毒用量：新生食蟹猴 2×10E13vg/kg，成年食蟹猴 5×10E13vg/kg
（Yao et al., Nat Biomed Eng, 2022）
4、可高效靶向神經(jīng)元細胞的血清型—AAV.CAP-B10
加州理工學院的 Viviana Gradinaru 團隊通過對 AAV9 進行衣殼改造，開發(fā)了一系列 AAV 變體，其中AAV.CAP-B10，靜脈注射后，不僅能夠突破血腦屏障，高效靶向神經(jīng)元細胞，同時不會在肝臟富集。
該研究團隊對比了不同 AAV 血清型通過靜脈注射在各組織器官中的遞送效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AAV. CAP-B10 表現(xiàn)出對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性，高度靶向神經(jīng)元細胞，對肝臟具有低靶向性，這一結(jié)果不僅在小鼠上得到了證實，在非人靈長類動物狨猴上也得到了證實。這為腦研究工作者提供了新的工具策略，同時這也為腦部疾病提供了一種更安全、有效的治療選擇。
AAV.CAP-B10 高效靶向小鼠腦組織而非肝臟
啟動子：CAG 實驗動物：雄性 C57BL/6J 小鼠
注射方式：靜脈注射 病毒用量：5×1011VG/mice
（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）
在狨猴中，AAV.CAP-B10 特異性靶向神經(jīng)元
啟動子：CAG；實驗動物：成年狨猴；
注射方式：靜脈注射；病毒用量：7×1013VG/KG
（David Goertsen et al., Nature Neuroscience, 2022）
5、可高效靶向星形膠質(zhì)細胞的血清型—rAAV11
星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的關(guān)鍵反應細胞，在脊髓損傷的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。星形膠質(zhì)細胞功能障礙已被證實是腦卒中、阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病的核心特征。中科院徐富強團隊對一系列工具病毒進行改造和篩選，開發(fā)了一種新的高效逆行靶向投射神經(jīng)元的重組腺相關(guān)病毒 rAAV11。研究發(fā)現(xiàn)，rAAV11 可以高效逆行靶向投射神經(jīng)元，且不表現(xiàn)出順行跨突觸特征；rAAV11 還具備優(yōu)秀的逆行標記效率，能示蹤 rAAV2 難以轉(zhuǎn)導的投射神經(jīng)元。值得注意的是，rAAV11 可以高效且特異性靶向星形膠質(zhì)細胞，為星形膠質(zhì)細胞的研究提供了更加有力的病毒工具。
rAAV11 靶向星形膠質(zhì)細胞
啟動子：GfaABC1D；實驗動物：C57BL/6J 小鼠；
注射部位：齒狀回（DG）區(qū)；病毒用量：2×109 VG/mice
（Han et al., bioRxiv preprint, 2022）
6、可高效靶向小膠質(zhì)細胞的血清型—AAV-cMG & AAV-MG
北京生命科學研究所羅敏敏實驗室通過定向進化策略，開發(fā)了一系列能夠在體內(nèi)和體外高效侵染小膠質(zhì)細胞的新型 rAAV 載體。該研究針對 AAV9 的衣殼蛋白進行改造，鑒定篩選出兩個衣殼蛋白（AAV-cMG. WPP 和 AAV-cMG.QRP）能夠在一定程度上提高 rAAV 病毒對體外培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細胞的侵染效率。以此為基礎(chǔ)，研究團隊針對 AAV-cMG.QRP 的插入肽段及其在衣殼蛋白插入位點的相鄰氨基酸進行突變篩選，成功得到了高效侵染體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞的 AAV-cMG 衣殼蛋白，同時并不導致小膠質(zhì)細胞的激活。
體外篩選得到 AAV-cMG
啟動子：CMV；轉(zhuǎn)染細胞：小膠質(zhì)細胞；MOI：104
（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）
研究人員進一步在 AAV-cMG.WPP 基礎(chǔ)之上構(gòu)建新的 AAV 突變文庫，并在小膠質(zhì)細胞特異的 Cx3cr1-CreER 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)進行針對性體內(nèi)篩選，成功鑒定得到 AAV-MG1.1 和 AAV-MG1.2，能夠在體內(nèi)高效侵染小膠質(zhì)細胞，且不誘導小膠質(zhì)細胞免疫激活。
體內(nèi)篩選得到 AAV-MG1.1/1.2 高效轉(zhuǎn)導小膠質(zhì)細胞
啟動子：CMV；實驗動物：Cx3cr1-CreER 轉(zhuǎn)基因小鼠；
注射部位：紋狀體（800nl）和中腦（500nl）；
病毒滴度：5×107 vg.μl-1
（Lin et al., Nature Neuroscience, 2022）
這兩類分別適用于體外侵染培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞（AAV-cMG）和體內(nèi)侵染內(nèi)源性小膠質(zhì)細胞（AAV-MG）的新型 rAAV 載體，將有助于小膠質(zhì)細胞生物學及相關(guān)疾病機制的研究。
7、可高效靶向中樞血管內(nèi)皮細胞的血清型—AAV-BI30
腦血管內(nèi)皮細胞是表達在血管腔隙的一類中樞非神經(jīng)元細胞群體，作為血腦屏障的重要組成部分，參與許多關(guān)鍵的生理過程。美國麻省理工學院-哈佛大學布羅德研究所的 Benjamin E. Deverman 組和哈佛醫(yī)學院的 ChenghuaGu組開發(fā)了一種新的血清型 AAV-BI30，可在多個鼠系體內(nèi)以及體外高效轉(zhuǎn)導內(nèi)皮細胞。在相對較低的全身劑量下，該載體可轉(zhuǎn)導成年 C57BL/6 小鼠大腦、視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)中的大多數(shù)動脈、毛細血管和靜脈內(nèi)皮細胞。
AAV-BI30 能有效地通過動靜脈軸轉(zhuǎn)導大腦內(nèi)皮細胞
啟動子：CAG； 實驗動物：成年 C57BL/6J 小鼠；
注射方式：靜脈注射； 病毒用量：1×1011 vg/mice
（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH,2022）
AAV-BI30 靶向視網(wǎng)膜和脊髓血管系統(tǒng)的內(nèi)皮細胞
啟動子：CAG；實驗動物：成年 C57BL/6J 小鼠；
注射方式：靜脈注射；病毒用量：1×1011 vg/mice
（Krolak et al., NATuRE CARDIoVASCuLAR RESEARCH, 2022）
此外，AAV-BI30 在 CNS 中能實現(xiàn)高效的 Cre 介導的基因操縱。AAV-BI30 能高效的在中樞不同類型血管內(nèi)皮細胞中特異性表達，適用于神經(jīng)血管生物學相關(guān)研究，并有助于開發(fā)內(nèi)皮功能障礙類疾病的治療方法。
二、AAV載體的優(yōu)化選擇（ssAAV or scAAV）
根據(jù)細胞類型與實驗目的選擇好合適的血清型后，還可以進行實驗需要進行AAV載體的優(yōu)化選擇。腺相關(guān)病毒為單鏈DNA病毒（ssAAV）, 在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉(zhuǎn)化，才能啟動基因轉(zhuǎn)錄過程，這一過程限制了AAV載體介導的基因轉(zhuǎn)導，并直接影響病毒的感染效率。自身互補雙鏈DNA的腺相關(guān)病毒(scAAV)能夠克服這一限制，不需要經(jīng)歷一個由單鏈變?yōu)殡p鏈的過程，也就是說，雙鏈AAV病毒進入細胞后，可以直接表達，并且表達時間更快，表達水平更高。因此，在神經(jīng)研究中，也可以根據(jù)需要選擇scAAV載體，完成目的基因更快表達，或者基因更強表達的研究。
三、啟動子的選擇
除了AAV載體與血清型，啟動子和調(diào)控元件的優(yōu)化也十分必要。目前，研究中使用的廣譜型啟動子，如巨細胞病毒啟動子CMV、CMV增強子融合的雞?-肌動蛋白啟動子CAG等，可實現(xiàn)目的基因的高表達。四環(huán)素啟動子TRE作為誘導型啟動子，則可以在特定條件下啟動基因的表達。然而，神經(jīng)系統(tǒng)的組成極其復雜，腦部的精密研究非常關(guān)鍵，要想實現(xiàn)某個腦區(qū)甚至是某一類細胞的特異性感染，選擇一種特異性相對更強的啟動子尤為重要。
常見的神經(jīng)組織特異性啟動子
四、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的添加
AAV載體上轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的添加，對于mRNA的剪接及核輸出、mRNA的穩(wěn)定性及翻譯等具有重要意義，下面列舉兩個對于提高外源基因表達非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件。
1、內(nèi)含子
真核mRNA內(nèi)含子在真核生物基因表達調(diào)控中起著重要的作用，是轉(zhuǎn)基因研究中提高外源基因表達的重要元件之一。在多數(shù)情況下，真核mRNA內(nèi)含子的存在可以提高基因的表達水平，因為其剪接過程會影響mRNA新陳代謝的多個階段，包括轉(zhuǎn)錄、RNA編輯、pre-mRNA的加工、mRNA的出核運輸、翻譯等。所以說，在載體容量允許的情況下可添加一個內(nèi)含子，有助于刺激基因的表達。
2、WPRE元件
土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列WPRE是一段順式作用的RNA元件，放在多聚腺苷酸化信號之前可顯著增加mRNA的表達水平和翻譯效率，進而增強基因的表達，并且WPRE插入病毒載體中還可以大大提升病毒包裝的滴度。然而由于WPRE序列較長（600bp左右），所以還需要視具體的載體容量選擇性插入。
五、注射方式的選擇
目前AAV在神經(jīng)系統(tǒng)研究中的注射方法主要有以下幾種：腦實質(zhì)內(nèi)注射、靜脈注射、腦室注射（ICV）、枕大池內(nèi)注射（ICM）和鞘內(nèi)注射（IT），其中ICV、ICM和IT注射是通過腦脊髓液進行傳遞。每種注射方式各有優(yōu)缺點，研究者可根據(jù)具體的研究對象以及實驗方案，選擇適合的注射方式，推薦進行預實驗對實驗效果做初步測試，以得到更優(yōu)的選擇方案。
四種常用AAV神經(jīng)給藥特點
（Ocana-Santero G et al. ，International Journal of Molecular Sciences, 2021）
下面介紹幾種常用注射方法及相應的病毒注射劑量：
（1）腦立體定位注射
腦立體定位注射，相比其他注射方式靶向性強，注射病毒體積小，但是侵入性也強，且對操作者具有很高的要求。在立體定位手術(shù)時，顱骨上常用的注射參照點是前囟，也就是中矢狀冠狀縫的交叉點（下圖B中的十字交叉點）。具體操作步驟如下：
1. 實驗動物稱重，進行麻醉；
2. 待實驗動物完全麻醉后，用剃毛器將動物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發(fā)剃除干凈；
3. 將麻醉后的實驗動物固定于腦立體定位儀上；
具體操作為：實驗動物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護其雙眼；將門齒掛在門齒掛鉤上，確保頭部保持固定；檢查左右耳桿是否在同一水平上，將左右耳桿通過外耳道插入實驗動物耳內(nèi)。實驗動物固定好的標準為：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉，目測大腦放置水平；
4. 手術(shù)：用碘伏/ 無色葡萄糖氯己定溶液對實驗動物頭皮進行消毒清理，用手術(shù)刀沿中間位置剪開頭皮，用鑷子對表面的結(jié)締組織進行清理，暴露實驗動物的顱骨表面；然后進行調(diào)平，首先找到前囟這個坐標，并將其歸零，然后向左右調(diào)平，使左右兩側(cè)處于同一水平，調(diào)整前后囟，使前后囟也在同一水平；
5. 病毒注射：通過查詢實驗動物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區(qū)的位置（下方圖片是大鼠和小鼠的腦譜），并確定其坐標值，即ML 值（X 軸）、AP 值（Y 軸）、DV 值（Z 軸）；根據(jù)目標腦區(qū)設(shè)定好坐標，移開注射針，用顱骨鉆開窗( 由于顱骨薄, 故務必注意顱骨鉆的力度??！), 操作時避免傷及腦組織；微量注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上，根據(jù)設(shè)好的坐標進行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μL/min，注射劑量視具體實驗而定。注射完畢，留針10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回針；
6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動物蘇醒后,正常喂養(yǎng), 病毒注射后2-4 周可檢測轉(zhuǎn)基因的表達。
提示：若手術(shù)麻醉時間較長，建議不要用酒精消毒，防止酒精揮發(fā)導致動物體溫過低而死亡。手術(shù)過程和蘇醒過程注意保暖。
腦立體定位注射示意圖
（Van der Perren A et al. JOVE-J VIS EXP. 2016）
（2）鞘內(nèi)注射
與系統(tǒng)注射和實質(zhì)內(nèi)注射相比，鞘內(nèi)給藥是一種具有較低劑量要求的微創(chuàng)替代方法。步驟如下：
1、使用毛巾覆蓋在小鼠頭部和背部，露出髂嵴以下的腰部區(qū)域；用非慣用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髖骨)，手的頂部輕輕放在小鼠身體和頭部上，使其保持平靜。
注：在髂骨上的握力應該足夠強，以固定小鼠的腿部活動，并使腿部向外和向下伸展。
2、使用慣用手食指從腰椎到骶部沿脊柱輕輕按壓，同時使用非慣用手輕輕上拉小鼠，以打開椎節(jié)之間的空間，方便進針。
3、將1 ?”號針的斜面指向小鼠頭部，然后將針以70°角插入脊柱中線的腰椎處，當感覺針碰到骨頭時，將針的角度調(diào)整到30°夾角，并將針插入椎節(jié)之間。
注：需多次嘗試找到合適的進入點，針頭進入脊柱后推針沒有阻力，尾巴或后腿的反射性彈跳出現(xiàn)時，說明已正確入針。
4、輕輕壓下注射器的活塞，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛網(wǎng)膜下腔。
注：注射時間控制在10-30s較好，速度太快會導致小鼠后腿抽筋，該現(xiàn)象會在60s內(nèi)消失。
5、注射后，將針180°旋轉(zhuǎn)1-2次，然后將針從脊柱中取出。
6、小鼠放回籠子觀察，確認恢復正常運動功能。
注：此法適用于成年小鼠或大鼠。
（3）靜脈注射
系統(tǒng)性給藥方式，侵入性較小，但是相比其他注射方式特異性也較差，因此所需病毒體積更大。步驟如下：
新生小鼠的顳靜脈注射
1、調(diào)整光源位置以便照亮顯微鏡區(qū)域，中等強度的光照為佳。
2、將一個新生幼鼠直接置于冰上1-3min，進行麻醉。
3、當動物在冰上麻醉時，在注射器中注滿AAV病毒，注射體積不應超過100μL。
4、在顯微鏡下觀察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻處，中指放在耳芽處，以便拉伸幼鼠的皮膚，可見顳淺靜脈。
5、確定顳淺靜脈。可通過皮膚看到位于耳芽前部，周圍毛細血管下部，有一條隱約可見的靜脈血管，從背部到腹部，匯入頸靜脈，這就是顳淺靜脈。
6、注射器針尖斜面插入顳靜脈?？梢钥吹结樇庑泵嫱ㄟ^皮膚的以后被血填充。輕壓注射器，并注意幼鼠臉側(cè)面的靜脈變白。
成年小鼠眶后靜脈注射
1、注射異氟醚對小鼠進行麻醉，使用非慣用手手掌握住小鼠背部，將拇指放在氣管正側(cè)面，頭部皮毛攏至手掌，使小鼠眼球凸起。
2、將手腕支撐在穩(wěn)定的表面上，用拇指、中指和無名指握住注射器，將食指放在柱塞上方。
3、對小鼠施加輕微壓力使眼睛凸出，針頭對準內(nèi)眥，斜面朝外，將針頭以45°插入眶后竇中心約5mm；
4、使用0.5ml 28G注射器緩慢注入150-200μL病毒懸液；
5、緩慢地取出針頭，確保針頭不會劃傷眼角膜。使用無菌紗布止血，并在眼睛上涂抹藥膏助其恢復。
6、注射后，將小鼠放回籠中恢復直至清醒。
成年小鼠眶后靜脈注射
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
尾靜脈注射
1、將小鼠放入約束器中，使尾巴從開口處露出。避免過度限制小鼠，以免導致其呼吸受阻。
2、在尾部涂抹70%異丙醇。
3、將小鼠尾巴拉直，可看到尾巴兩側(cè)各有一條側(cè)脈。
4、將針尖以30°角插入側(cè)靜脈中。一旦針尖穿過了靜脈的一半，重新調(diào)整針頭，使其與靜脈的長度一致(圖3c)。如果針頭插入正確，則按壓注射器注射時應無阻力。
5、使用0.5ml 28G注射器緩慢注射300μLAAV病毒懸液，此時靜脈顏色會變白，大約4s后，顏色恢復正常。
6、小心將針頭取出，用吸水紗布按壓注射部位10秒進行止血。
7、將小鼠放回籠子。
尾靜脈注射
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
小結(jié)
值得注意的是，除了以上所述各項因素外，AAV病毒本身的滴度和純度，目的基因本身的自然屬性（如胞內(nèi)蛋白/分泌蛋白/轉(zhuǎn)運蛋白）以及AAV感染后所使用的檢測方法等因素也會影響到基因最終的表達效果。因此，在神經(jīng)系統(tǒng)研究中，想要驅(qū)動更高效的基因轉(zhuǎn)導，可以綜合考慮以上各項因素，優(yōu)化選擇。
AAV在腦組織中的靶向策略（應用篇）（可點擊查看）
