維真AAV病毒在高血壓腦出血中的應用
研究背景
高血壓腦出血是非常嚴重的一類高血壓并發(fā)癥，已成為人類重大健康負擔。盡快明確高血壓腦出血發(fā)病機制以及干預中年人腦出血風險已刻不容緩。但目前針對高血壓腦出血相關發(fā)病機制的研究還很不成熟，并且沒有針對預防腦出血的藥物投入臨床應用。中國醫(yī)學科學院阜外醫(yī)院陳敬洲教授團隊承擔題為“豆紋動脈神經(jīng)復合體”區(qū)易發(fā)腦出血的遺傳、環(huán)境危險因素及預警生物標志研究”的973研究項目，主要致力于高血壓腦出血的機制研究。
通過GEO數(shù)據(jù)庫，該團隊將人外周血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞外顯子芯片結果（GSE15805）與人腦血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞外顯子芯片結果（GSE19090）進行交叉比對后發(fā)現(xiàn)，包括Plod3（編碼賴氨酸羥化酶-3，LH3）在內(nèi)的多種基因在腦血管平滑肌的表達水平較顱外平滑肌顯著降低，且在腦血管平滑肌中尤為明顯，進一步通過網(wǎng)絡通路分析發(fā)現(xiàn)該基因處于富集通路的關鍵節(jié)點位置，因此推測上述基因可能與高血壓腦出血血管病變密切相關。（文章所用AAV9-LH3產(chǎn)品由維真生物提供）
路線設計
首先該團隊構建了小鼠高血壓腦出血模型，提取正常對照組及高血壓腦出血組小鼠的腦血管RNA及蛋白，在mRNA水平及蛋白水平分別檢測發(fā)現(xiàn)，在高血壓腦出血時，小鼠腦血管Plod3顯著下調(diào)。因此，該團隊認為Plod3基因在高血壓腦出血中可能發(fā)揮重要的保護作用。
部分成果展示
首先，研究者利用AAV9- Plod3轉基因的病毒載體，通過立體定位注射的方法將病毒注射入小鼠側腦室，4周后檢測病毒感染情況及LH3在腦血管的表達情況。結果如圖一所示，通過腦整體切片檢測綠色熒光蛋白，提取腦血管蛋白進行Western Blot以及免疫熒光多重方法檢測，確認了LH3基因確實在小鼠全腦中的過表達。立體定位注射分位置為前囟點后退0.2mm旁開1mm深2.7mm，注射病毒體積為2μL。
圖一、AAV-LH3在小鼠全腦中的過表達
進而，采用血管緊張素（AngII）皮下埋泵的方法來構建小鼠高血壓模型，但前期預實驗結果提示，單純AngII輸注并不會引起小鼠高血壓腦出血的發(fā)生，需要同時給予L-NAME，一種非選擇性內(nèi)皮一氧化氮合酶抑制劑聯(lián)合應用，才能成功構建高血壓腦出血模型。研究者進一步對各處理組高血壓腦出血的發(fā)生情況進行了生存曲線描繪，結果顯示高血壓腦出血組小鼠28天時腦出血發(fā)生率為80%，Plod3過表達組腦出血發(fā)生率僅為30%，Plod3過表達組小鼠腦出血發(fā)生率顯著下降，P<0.001。
圖二、LH3 過度表達可以改善細胞外基質(zhì)重塑和炎癥過程
隨后，該團隊對Plod3抑制高血壓腦出血的機制進行了深入探討。通過對腦出血前分離的小鼠腦血管進行RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，Plod3主要通過抑制膠原重塑、減少血管周圍炎癥及抑制腦血管平滑肌細胞凋亡等多個層面減少高血壓腦出血的發(fā)生風險及腦出血嚴重程度（如圖二與圖三所示）。
圖三、過表達LH3能顯著抑制血管平滑肌細胞的凋亡
本研究已被國際腦卒中研究領域的頂級主流期刊《Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism》接收，影響因子6.2。
圖四、過表達LH3抑制腦出血模型
本課題的最亮眼的技術方法就是，利用維真生物公司構建的AAV9過表達Plod3，通過立體定位注射技術，突破血腦屏障的阻礙，在特定的腦區(qū)高表達Plod3以達到抑制高血壓腦出血發(fā)生的目的。這為臨床上高血壓腦出血的預防手段提供了新的切入點，為生物醫(yī)學轉化找到了新的思路。
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