維真AAV病毒在高血壓腦出血中的應(yīng)用
研究背景
高血壓腦出血是非常嚴(yán)重的一類高血壓并發(fā)癥，已成為人類重大健康負(fù)擔(dān)。盡快明確高血壓腦出血發(fā)病機(jī)制以及干預(yù)中年人腦出血風(fēng)險(xiǎn)已刻不容緩。但目前針對(duì)高血壓腦出血相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究還很不成熟，并且沒(méi)有針對(duì)預(yù)防腦出血的藥物投入臨床應(yīng)用。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院陳敬洲教授團(tuán)隊(duì)承擔(dān)題為“豆紋動(dòng)脈神經(jīng)復(fù)合體”區(qū)易發(fā)腦出血的遺傳、環(huán)境危險(xiǎn)因素及預(yù)警生物標(biāo)志研究”的973研究項(xiàng)目，主要致力于高血壓腦出血的機(jī)制研究。
通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，該團(tuán)隊(duì)將人外周血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞外顯子芯片結(jié)果（GSE15805）與人腦血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞外顯子芯片結(jié)果（GSE19090）進(jìn)行交叉比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，包括Plod3（編碼賴氨酸羥化酶-3，LH3）在內(nèi)的多種基因在腦血管平滑肌的表達(dá)水平較顱外平滑肌顯著降低，且在腦血管平滑肌中尤為明顯，進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)通路分析發(fā)現(xiàn)該基因處于富集通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)位置，因此推測(cè)上述基因可能與高血壓腦出血血管病變密切相關(guān)。（文章所用AAV9-LH3產(chǎn)品由維真生物提供）
路線設(shè)計(jì)
首先該團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了小鼠高血壓腦出血模型，提取正常對(duì)照組及高血壓腦出血組小鼠的腦血管RNA及蛋白，在mRNA水平及蛋白水平分別檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在高血壓腦出血時(shí)，小鼠腦血管Plod3顯著下調(diào)。因此，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為Plod3基因在高血壓腦出血中可能發(fā)揮重要的保護(hù)作用。
部分成果展示
首先，研究者利用AAV9- Plod3轉(zhuǎn)基因的病毒載體，通過(guò)立體定位注射的方法將病毒注射入小鼠側(cè)腦室，4周后檢測(cè)病毒感染情況及LH3在腦血管的表達(dá)情況。結(jié)果如圖一所示，通過(guò)腦整體切片檢測(cè)綠色熒光蛋白，提取腦血管蛋白進(jìn)行Western Blot以及免疫熒光多重方法檢測(cè)，確認(rèn)了LH3基因確實(shí)在小鼠全腦中的過(guò)表達(dá)。立體定位注射分位置為前囟點(diǎn)后退0.2mm旁開(kāi)1mm深2.7mm，注射病毒體積為2μL。
圖一、AAV-LH3在小鼠全腦中的過(guò)表達(dá)
進(jìn)而，采用血管緊張素（AngII）皮下埋泵的方法來(lái)構(gòu)建小鼠高血壓模型，但前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，單純AngII輸注并不會(huì)引起小鼠高血壓腦出血的發(fā)生，需要同時(shí)給予L-NAME，一種非選擇性內(nèi)皮一氧化氮合酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，才能成功構(gòu)建高血壓腦出血模型。研究者進(jìn)一步對(duì)各處理組高血壓腦出血的發(fā)生情況進(jìn)行了生存曲線描繪，結(jié)果顯示高血壓腦出血組小鼠28天時(shí)腦出血發(fā)生率為80%，Plod3過(guò)表達(dá)組腦出血發(fā)生率僅為30%，Plod3過(guò)表達(dá)組小鼠腦出血發(fā)生率顯著下降，P<0.001。
圖二、LH3 過(guò)度表達(dá)可以改善細(xì)胞外基質(zhì)重塑和炎癥過(guò)程
隨后，該團(tuán)隊(duì)對(duì)Plod3抑制高血壓腦出血的機(jī)制進(jìn)行了深入探討。通過(guò)對(duì)腦出血前分離的小鼠腦血管進(jìn)行RNA-seq研究發(fā)現(xiàn)，Plod3主要通過(guò)抑制膠原重塑、減少血管周圍炎癥及抑制腦血管平滑肌細(xì)胞凋亡等多個(gè)層面減少高血壓腦出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)及腦出血嚴(yán)重程度（如圖二與圖三所示）。
圖三、過(guò)表達(dá)LH3能顯著抑制血管平滑肌細(xì)胞的凋亡
本研究已被國(guó)際腦卒中研究領(lǐng)域的頂級(jí)主流期刊《Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism》接收，影響因子6.2。
圖四、過(guò)表達(dá)LH3抑制腦出血模型
本課題的最亮眼的技術(shù)方法就是，利用維真生物公司構(gòu)建的AAV9過(guò)表達(dá)Plod3，通過(guò)立體定位注射技術(shù)，突破血腦屏障的阻礙，在特定的腦區(qū)高表達(dá)Plod3以達(dá)到抑制高血壓腦出血發(fā)生的目的。這為臨床上高血壓腦出血的預(yù)防手段提供了新的切入點(diǎn)，為生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化找到了新的思路。
