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AAV在心臟研究中的靶向策略【干貨篇】

心血管疾病是影響人類死亡率的一個(gè)主要原因。近年來，基因療法已成為治療和治愈受損心血管組織的一種有前景的方法，能夠使心臟從無功能狀態(tài)恢復(fù)到正常狀態(tài)。AAV可在心臟組織有效、持久、穩(wěn)定、安全地表達(dá)外源基因，因而在心臟基因治療策略中占據(jù)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)表明，通過AAV攜帶治療基因?qū)π难芗膊∪缧牧λソ摺⑿募∪毖?、心肌梗死后心臟重構(gòu)等均有積極效果。在使用rAAV進(jìn)行心臟研究時(shí)，正確選擇AAV血清型、啟動(dòng)子以及注射方式是實(shí)驗(yàn)順利開展的必備條件。今天小V就和大家一起來學(xué)習(xí)一下AAV在心臟研究中的優(yōu)化策略，以提高AAV的基因轉(zhuǎn)移效率。

01. 血清型的選擇

AAV血清型多種多樣，在心臟研究中AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9型對(duì)心臟有較好的感染效率，其中AAV8和AAV9的感染效率較優(yōu)于其他血清型，AAV9是目前公認(rèn)的高效特異性靶向心臟表達(dá)的病毒載體血清型。盡管AAV8的感染效果也不錯(cuò)，但是沒有AAV9的擴(kuò)散性好。臨床上靶向心肌的AAV血清型一般為1，6和9型，其中AAV1和AAV6均可有效靶向心肌和骨骼肌細(xì)胞，而AAV9則更加傾向于對(duì)心肌的感染。

圖1.五種AAV血清型對(duì)心臟感染效率檢測(cè)

圖2.不同血清型與不同病毒量感染心臟的效果圖
（Prasad K et al. Gene Therapy, 2011）

02. 啟動(dòng)子的選擇

常見的廣譜型啟動(dòng)子CMV、CAG即可在心臟中較好表達(dá)，如果特異性要求不高的話可以選擇CMV啟動(dòng)子，其對(duì)心臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很高。

圖3. AAV9-CMV與AAV9-CBA介導(dǎo)的心肌中GFP表達(dá)情況（1w、3w、5w、8w）
(■) CMV; (■) CBA.
（BD Chen et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 2015）

若要實(shí)現(xiàn)目的基因在心臟中特異性表達(dá)，推薦選擇心臟特異性的啟動(dòng)子，如cTNT、αMHC、Des、MLC2v等，其中cTNT和αMHC兩種啟動(dòng)子應(yīng)用較為廣泛。

圖4.cTnT啟動(dòng)子在心臟表達(dá)的特異性更強(qiáng) （Prasad K,Xu Y, Yang Z,et al. Gene Therapy, 2011）

03. 注射方式的選擇

AAV在心臟的注射方式有多種，心肌原點(diǎn)注射、冠狀動(dòng)脈注射、頸靜脈注射和尾靜脈注射均可以將藥物遞送到心臟，通常文獻(xiàn)報(bào)道較多的是心肌原點(diǎn)注射和尾靜脈注射。

心肌注射：

心肌注射是通過注射器或類似裝置將藥物直接注入心臟組織，多采用原位多點(diǎn)注射方式，注射體積20μL/site，3-5點(diǎn)注射，通常注射的總病毒量在10E11VG以上。與血管注射相比，心肌直接注射方法特異性較強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)感興趣區(qū)域的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)，但表達(dá)不均勻，只在注射部位周圍的區(qū)域進(jìn)行表達(dá)。

圖5.心肌注射（心外膜與心內(nèi)膜途徑）與心包注射 （Ishikawa K,et al. Journal of Gene Medicine,2011）

尾靜脈注射：

是將小鼠固定后通過尾部側(cè)面的靜脈注射使藥物傳遞到心臟。尾靜脈注射易于操作，但是特異性較心肌注射稍弱，注射體積在100μL-200μL左右，由于載體在全身廣泛分布，注射劑在血容量中會(huì)被稀釋，所以通常需要較高的病毒滴度。

頸靜脈注射：

頸靜脈注射時(shí)，在麻醉小鼠頸部做切口，并分離頸靜脈，用31G針將載體注入頸靜脈。此方法需要進(jìn)行手術(shù)，操作要求較高，且對(duì)動(dòng)物有傷害性。頸靜脈注射時(shí)，所注射的病毒總量約為20μL-100uL。

冠狀動(dòng)脈注射：

冠狀動(dòng)脈注射又分順行冠狀動(dòng)脈注射和逆行冠狀動(dòng)脈注射。

順行冠狀動(dòng)脈注射是通過導(dǎo)管直接注射載體，允許具有心臟選擇性的載體進(jìn)行微創(chuàng)遞送，由于其微創(chuàng)性該方法具有較大的優(yōu)勢(shì)，已廣泛用于臨床和實(shí)驗(yàn)基因治療研究。但由于內(nèi)皮細(xì)胞是載體到達(dá)心肌細(xì)胞的屏障，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相對(duì)較低，可以小劑量的持續(xù)注入或使用一些藥劑（如腺苷、組胺類、硝酸甘油等）來增加血管床的滲透性進(jìn)行改善。

圖6.順行冠狀動(dòng)脈注射 A、順行注射：通過導(dǎo)管直接注射載體；
B、使用V型聚焦系統(tǒng)進(jìn)行順行注射：注射的載體通過抽吸導(dǎo)管從冠狀竇中吸出，然后再循環(huán)到冠狀動(dòng)脈中；
C、冠狀動(dòng)脈阻塞的順行注射：將載體注射到阻斷冠狀動(dòng)脈血流的球囊遠(yuǎn)端
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

逆行冠狀動(dòng)脈注射是通過阻斷冠狀竇進(jìn)行壓力調(diào)節(jié)的逆向輸注，相比順行注射更加有效。然而，這種方法需要暫時(shí)中斷冠狀動(dòng)脈血流，以消除順行血流對(duì)壓力的影響。雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很高，但創(chuàng)傷較大，危險(xiǎn)性較高。

圖7.通過冠狀竇逆行注射 A、逆行注射:載體在冠狀動(dòng)脈阻塞時(shí)注入冠狀竇，冠狀竇的壓力由導(dǎo)管調(diào)節(jié)；
B、冠狀竇直接注射(TransAccess):利用血管內(nèi)超聲引導(dǎo)經(jīng)靜脈心肌穿刺，載體由微導(dǎo)管通過可擴(kuò)張針進(jìn)行注射
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

幾種常用注射方式的優(yōu)劣勢(shì)比較

04. 參考文獻(xiàn)

1. Prasad K , Xu Y , Yang Z , et al. Robust Cardiomyocyte-Specific Gene Expression Following Systemic Injection of AAV: In Vivo Gene Delivery Follows a Poisson Distribution[J]. Gene Therapy, 2011, 18(1):43-52.

2. Ishikawa K , Tilemann L , Fish K , et al. Gene delivery methods in cardiac gene therapy[J]. Journal of Gene Medicine, 2011, 13(10):566-572.

3. BD Chen , CH He , XC Chen , et al. Targeting transgene to the heart and liver with AAV9 by different promoters[J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2015, 42(10):1108-1117.

AAV在心臟研究中的靶向策略【應(yīng)用篇】（可點(diǎn)擊查看）