《Molecular Cell》‖ 維真AAV與自噬研究和脂代謝
研究背景
自噬是細(xì)胞中高度保守的生物學(xué)現(xiàn)象，能在脂代謝過程中扮演著重要角色。Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶（PI3KC3）在自噬過程中發(fā)揮著重要功能。作為PI3KC3的亞基之一，Pacer在提高PI3KC3激酶活性和自噬水平方面均能起到重要的作用，Pacer是浙大孫啟明課題組新近鑒定的一個(gè)脊椎動(dòng)物特有的自噬調(diào)控分子，相關(guān)工作已于2017年發(fā)表在了Mol Cell雜志上。最近的研究顯示，Pacer存在磷酸化和乙?；男揎?，本研究旨在研究Pacer對(duì)肝臟脂質(zhì)水平以及自噬發(fā)展的影響。
研究思路
首先，研究者利用腺相關(guān)病毒實(shí)現(xiàn)Pacer及其突變體在肝臟組織中的表達(dá)，分析Pacer磷酸化對(duì)小鼠肝臟自噬水平的影響；其次，通過建立非酒精性脂肪肝的小鼠模型，并在建模成功后將Pacer的多種乙?；蛔凅w病毒注射至小鼠體內(nèi)，觀察肝臟的脂質(zhì)水平以及自噬發(fā)展的水平。
部分研究成果
1. Pacer磷酸化對(duì)小鼠肝臟自噬水平的影響
研究人員采用腺相關(guān)病毒腹腔注射的方法，將 AAV-Pacer WT以及Pacer的多種變異體（PacerS157A和Pacer S157D）注射至小鼠體內(nèi)，并在注射后21天處死小鼠，分析肝臟細(xì)胞，檢測(cè)自噬水平的變化。結(jié)果如圖1所示：Western blot分析可見，肝臟組織經(jīng)腺相關(guān)病毒感染后，Pacer WT, Pacer S157A和Pacer S157D的表達(dá)水平顯著增加。
圖1. 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Pacer磷酸化變體在肝臟組織中的表達(dá)水平及其對(duì)自噬基因表達(dá)的影響
2. Pacer磷酸化對(duì)自噬溶酶體形成的影響
結(jié)果如圖2所示，采用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Pacer磷酸化變體補(bǔ)救Pacer敲降的U2OS細(xì)胞，可見過表達(dá)Pacer S157A的去磷酸化變體可顯著促進(jìn)自噬溶酶體的形成，而Pacer S157D的永久磷酸化變體則無(wú)法促進(jìn)自噬溶酶體的形成。
圖2. 免疫熒光分析腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Pacer磷酸化變體對(duì)自噬溶酶體形成的影響
3. Pacer乙?；瘜?duì)肝臟組織自噬水平的影響
非酒精性脂肪肝建模成功后，采用維真腺相關(guān)病毒在肝臟組織過表達(dá)Pacer WT和Pacer 2KR變體，結(jié)果如圖3所示：可見腺相關(guān)病毒介導(dǎo)Pacer及其變體可在肝臟組織中表達(dá)。
圖3. Western blot分析腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的Pacer乙酰化變體在肝臟組織中的表達(dá)情況
4. Pacer乙酰化對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響
結(jié)果如圖4所示，采用高脂飼料喂養(yǎng)建模后采用油紅染色和電鏡分析，顯示肝臟組織和細(xì)胞中脂質(zhì)水平顯著增加。而采用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)Pacer WT可顯著降低肝臟組織中脂質(zhì)水平，腺相關(guān)病毒介導(dǎo)Pacer 2KR（乙?；凅w）則無(wú)法有效降低肝臟中脂質(zhì)水平。
圖4. 油紅染色電子顯微鏡分析肝臟組織中脂質(zhì)水平的變化
1
文章小結(jié)：該工作闡明了脊椎生物特有的自噬調(diào)控基因Pacer如何感知上游營(yíng)養(yǎng)信號(hào)，進(jìn)而調(diào)控自噬體成熟和肝臟脂代謝的分子機(jī)制。這項(xiàng)工作不僅確定了Pacer蛋白是肝臟自噬和肝臟穩(wěn)態(tài)的調(diào)控者，而且還揭示了肝臟自噬的后期和脂質(zhì)代謝中的信號(hào)整合機(jī)制?！禡olecular Cell》（IF:14.248）
病毒產(chǎn)品及使用方法
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產(chǎn)品名稱
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血清型
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購(gòu)自
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AAV-mCherry-GFP-LC3
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AAV9
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維真生物
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AAV-Vector
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AAV9
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維真生物
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AAV-PacerWT-HA
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AAV9
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維真生物
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AAV-PacerS157A
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AAV9
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維真生物
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AAV-PacerS157D-HA
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AAV9
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維真生物
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AAV-Pacer2KR-HA
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AAV9
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維真生物
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病毒用量：1×10E11 cfu/只；
注射方法：腹腔注射；
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