『應(yīng)用篇』AAV在肺部應(yīng)用中的靶向策略
上一期小V和大家一起學(xué)習(xí)了關(guān)于rAAV在肺部實驗中的啟動子、血清型以及注射方式的選擇策略（『干貨篇』AAV在肺部應(yīng)用中的靶向策略），今天我們將和大家一起通過幾個具體案例深入了解一下關(guān)于AAV在肺部研究中的應(yīng)用策略。
維真生物AAV注射肺部案例展示
1、“SERPINB10 contributes to asthma by inhibiting the apoptosis of allergenic Th2 cells”
原文鏈接：https://respiratoryresearch.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12931-021-01757-1
哮喘（Asthma）是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的慢性炎癥性疾病，常伴隨有氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、大量粘液分泌和氣道重塑的特征。研究表明，輔助型T細(xì)胞2（Th2）及其分泌的細(xì)胞因子與哮喘發(fā)病機制密切相關(guān)；絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員SERPINB10與哮喘的過敏性炎癥有關(guān)，但其在過敏性哮喘Th2應(yīng)答中的作用尚不清楚。
在本研究中，作者通過抑制小鼠SERPINB10表達(dá)（利用AAV6載體進(jìn)行氣管內(nèi)注射），發(fā)現(xiàn)屋塵螨(HDM)誘導(dǎo)的氣道炎癥和Th2反應(yīng)有所緩解，HDM誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子分泌和HDM特異性IgE水平顯著降低，且誘導(dǎo)了Th2的凋亡增加。本文揭示了SERPINB10通過抑制Th2細(xì)胞的凋亡促進(jìn)哮喘的炎癥發(fā)生，闡明了SERPINB10在過敏性哮喘Th2反應(yīng)中的重要作用。
如圖1所示，研究人員通過HDM誘導(dǎo)構(gòu)建了哮喘小鼠模型，借助AAV6下調(diào)SERPINB10的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織中SERPINB10的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，干擾率約為74.2%。AAV6-SERPINB10 shRNA對于HMD誘導(dǎo)的SERPINB10高表達(dá)同樣可以起到很好的干擾效果，并表現(xiàn)為持久有效地抑制。
圖1. AAV6-Serpinb10shRNA干擾效率檢測
2、“circHIPK3 regulates lung fibroblast-tomyofibroblast transition by functioning as a competing endogenous RNA”
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41419-019-1430-7
特發(fā)性肺纖維化（IPF）是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，發(fā)病機制尚不完全清楚，迫切需要新的靶向藥物來阻止其纖維化過程。肺內(nèi)形成由肌成纖維細(xì)胞組成的纖維化灶和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的異常表達(dá)是IPF的顯著病理特征，而肌成纖維細(xì)胞主要來源于成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化（FMT），因此，了解IPF中FMT過程的調(diào)控機制或許將會為IPF治療提供新的靶點。circHIPK3已被鑒定在肺中高表達(dá)，且在人成纖維細(xì)胞中富集。然而，circHIPK3是否參與介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能尚不清楚。
研究人員利用博萊霉素(BLM)制備IPF小鼠模型，探究了circHIPK3在肺纖維化中的作用，發(fā)現(xiàn)circHIPK3在肺纖維化小鼠模型，F(xiàn)MT衍生的肌成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)；沉默circHIPK3（通過AAV6載體進(jìn)行氣管內(nèi)注射）可以在體內(nèi)外抑制成纖維細(xì)胞增殖并改善FMT。從機制上來講，circHIPK3作為內(nèi)源性miR-338-3p的海綿調(diào)控FMT：circHIPK3通過抑制miR-338-3p活性導(dǎo)致FMT調(diào)控因子SOX4和COL1A1表達(dá)增加?？偟膩碚f，circHIPK3的干預(yù)可能為肺纖維化的治療提供新的見解。
如圖2所示，通過氣管內(nèi)注射AAV6-circHIPK3 shRNA顯著降低了circHIPK3在肺中的表達(dá)，沉默circHIPK3后減弱了BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠中的膠原沉積，并降低了肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA和Col-1的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，circHIPK3沉默顯著改善了BLM誘導(dǎo)的肺纖維化，抑制肺成纖維細(xì)胞增殖。
圖2. circHIPK3沉默可減輕BLM誘導(dǎo)的肺纖維化并改善體內(nèi)成纖維細(xì)胞功能障礙
3、“Sirtuin 6 inhibits epithelial to mesenchymal transition during idiopathic pulmonary fibrosis via inactivating TGF-β1/Smad3 signaling”。
原文鏈接：https://www.oncotarget.com/article/17723/text/
特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種不可逆、進(jìn)行性、平均生存期短的間質(zhì)性肺疾病，其特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積和肺結(jié)構(gòu)受損，目前尚無有效的治療方法，迫切需要從機制上了解其發(fā)病機制，以開發(fā)治療這一疾病的新方法。目前已發(fā)現(xiàn)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）參與了特發(fā)性肺纖維化的發(fā)病機制，確定調(diào)節(jié)EMT或?qū)㈤g充質(zhì)細(xì)胞去分化為上皮細(xì)胞的關(guān)鍵分子是抑制或逆轉(zhuǎn)IPF的一種有吸引力的治療策略。SIRT6參與控制衰老、癌癥和新陳代謝，已被證明在心臟和肝臟具有抗纖維化功能。然而，SIRT6是否參與肺EMT，抑制特發(fā)性肺纖維化（IPF）尚不清楚。
在本研究中，研究人員首先通過體外研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中Sirt6表達(dá)上調(diào)，且過表達(dá)Sirt6可負(fù)調(diào)控EMT進(jìn)程，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和間充質(zhì)細(xì)胞行為。隨后通過體內(nèi)研究表明，通過AAV載體使Sirt6在小鼠肺部成功表達(dá)，可以消除博萊霉素（BLM）誘導(dǎo)的EMT樣表型和肺纖維化，揭示了Sirt6在肺EMT過程中的關(guān)鍵作用，并可能成為特發(fā)性肺纖維化的一個潛在治療靶點。
如圖3所示，通過氣管內(nèi)注射AAV-Sirt6后，Sirt6在肺泡壁成功表達(dá)，Sirt6過表達(dá)明顯消除了博來霉素誘導(dǎo)的EMT表型并緩解了肺纖維化。
圖3. AAV-Sirt6可改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺EMT
4、“l(fā)ncRNA ZFAS1 promotes lung fibroblast-to-myofibroblast transition and ferroptosis via functioning as a ceRNA through miR-150- 5p/SLC38A1 axis”。
原文鏈接：https://www.aging-us.com/article/103176/text
越來越多的證據(jù)表明，lncRNA參與了肺纖維化（PF）的多種病理生理過程，其中l(wèi)ncRNA ZFAS1被報道可能參與了PF進(jìn)展，但其作用及機制有待進(jìn)一步闡明。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)lncRNA ZFAS1在博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的PF大鼠肺組織和TGF-β1處理的HFL1細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并與脂質(zhì)過氧化的重要調(diào)節(jié)因子SLC38A1的表達(dá)呈正相關(guān)。此外，lncRNA ZFAS1的體內(nèi)外敲低實驗表明，干擾lncRNA ZFAS1的表達(dá)可以抑制BLM誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和PF的形成，伴隨SLC38A1的下調(diào)。最后，作者揭示了lncRNA ZFAS1/miR-150-5p/SLC38A1通路在PF進(jìn)展中的作用，這可能為PF患者的治療提供新的靶點。
腹腔注射表達(dá)lncRNA ZFAS1 的AAV5敲低載體后，明顯減弱了BLM誘導(dǎo)的肺纖維化特征。此外，lncRNA ZFAS1的敲低顯著增加了BLM誘導(dǎo)的PF大鼠模型肺組織中miR-150-5p的表達(dá)，并降低了SLC38A1 mRNA的表達(dá)，同時減弱了BLM誘導(dǎo)的炎性因子的表達(dá)、脂質(zhì)過氧化和鐵死亡?？偟膩碚f，lncRNA ZFAS1的下調(diào)通過調(diào)節(jié)miR-150-5p/SLC38A1通路顯著減弱BLM誘導(dǎo)的肺纖維化和鐵死亡（圖4）。
圖4. lncRNA ZFAS1敲低通過調(diào)控miR-150-5p/SLC38A1通路阻斷BLM誘導(dǎo)的PF
5、“ALDH2 (Aldehyde Dehydrogenase 2) Protects Against Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension”。
原文鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/ATVBAHA.119.312946
肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是由多種已知或未知原因引起的肺動脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)。缺氧性肺動脈高壓(HPH)是常見的PH類型，目前尚無有效治療藥物，因此，有必要深入了解HPH的潛在機制，以確定潛在的新治療靶點。HPH會導(dǎo)致肺動脈平滑肌細(xì)胞PASMCs過度增殖，并促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生包括4-羥基壬烯醛(4-HNE)等在內(nèi)的有毒醛。有研究表明，醛脫氫酶2(ALDH2)作為重要的醛類解毒酶，可通過清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的有毒醛，特別是4-HNE，能在心肌損傷和中風(fēng)中起保護(hù)作用，且ALDH2的激活可以緩解野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓，盡管如此，ALDH2在HPH中的作用及其潛在機制尚未被充分研究。
為了確定ALDH2 在HPH的作用, 研究人員以ALDH2轉(zhuǎn)基因小鼠、C57BL/6J小鼠,和ALDH2基因敲除(ALDH2?/?)小鼠為實驗對象，將其暴露在慢性缺氧環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)慢性缺氧促進(jìn)了肺組織中4-HNE的產(chǎn)生，HPH小鼠肺組織中ALDH2表達(dá)下調(diào)。隨后通過多種途徑證明ALDH2的激活可降低4-HNE的水平，減輕HPH的發(fā)生程度，并調(diào)控PASMCs的增殖和遷移。
肺動脈平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在HPH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為確定ALDH2通過哪種細(xì)胞在HPH中發(fā)揮作用，研究者利用AAV1 -ICAM2-ALDH2和AAV2-SM22α-ALDH2分別在小鼠肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中特異性過表達(dá)ALDH2，發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射AAV病毒后，平滑肌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中均出現(xiàn)強烈的GFP熒光信號，且右心室收縮壓RVSP、右室肥厚指數(shù)RVH和肺血管肌化的檢測結(jié)果表明，在肺動脈平滑肌細(xì)胞而非內(nèi)皮細(xì)胞中特異性過表達(dá)ALDH2可抑制HPH的發(fā)生（圖5）。
圖5. 肺動脈平滑肌細(xì)胞（而非內(nèi)皮細(xì)胞）中過表達(dá)ALDH2可抑制HPH的發(fā)生
