『重磅盤點(diǎn)』AAV在腎臟研究中的應(yīng)用策略
『重磅盤點(diǎn)』AAV在腎臟研究中的應(yīng)用策略
腎臟疾病已成為威脅人類健康的主要疾病之一，全球約有13%人口受其影響。已知由基因突變引起的慢性腎臟疾病的發(fā)病率可高達(dá)千分之一，近80種基因的突變都與各種遺傳性腎臟疾病有關(guān)。然而，由于腎臟結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，針對(duì)腎臟疾病的基因治療的研究和開發(fā)滯后于肝臟、神經(jīng)肌肉和眼睛等。自20世紀(jì)90年代末以來，研究人員已經(jīng)開始利用AAV進(jìn)行體內(nèi)外腎臟的基因傳遞研究，并取得一定的成果，然而所帶來的實(shí)際轉(zhuǎn)導(dǎo)效果存在很大程度的不同，這可能與不同的傳遞方式以及不同的AAV血清型等因素有關(guān)。如何實(shí)現(xiàn)或者更大程度上實(shí)現(xiàn)外源基因在腎臟中的轉(zhuǎn)導(dǎo)成為影響腎臟基因治療發(fā)展的關(guān)鍵。
1.注射方式的選擇
圖1. 腎臟結(jié)構(gòu)示意圖和腎皮質(zhì)的顯微圖像
（van der Wouden, E.A., et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 2004.）
給藥途徑的選擇是基因治療有效性的重要決定因素。 哺乳動(dòng)物的腎臟具有嚴(yán)格的過濾功能，排斥大于50kDa的蛋白質(zhì)，此外，腎小球內(nèi)的足細(xì)胞形成直徑僅為10nm的狹縫橫膈膜，傳統(tǒng)的AAV載體全身給藥難以在腎臟達(dá)到足夠的表達(dá)水平，即便是高劑量給藥也會(huì)導(dǎo)致AAV集中在肝臟等腎外器官中。為了提高病毒載體對(duì)腎臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)并降低病毒載體對(duì)腎外器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，除了全身給藥方式外，近年來，科學(xué)家陸續(xù)開發(fā)了 腎臟局部給藥途徑 包括 腎動(dòng)脈注射、腎靜脈注射、經(jīng)腎實(shí)質(zhì)注射、經(jīng)輸尿管逆行給藥和經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射等 (圖2)。
圖2. 腎臟AAV給藥方式
(A) 腎動(dòng)脈灌注，通過導(dǎo)管或注射器；(B)腎靜脈逆行灌注；(C)逆行輸尿管灌注；(D)經(jīng)腎囊壁直接向腎實(shí)質(zhì)注射。
（Rubin, J.D. and M.A. Barry. Mol Diagn Ther, 2020.）
如下表所列，這些以手術(shù)為基礎(chǔ)的AAV給藥方法實(shí)現(xiàn)了外源基因在腎臟中不同分布模式，且具有不同的特點(diǎn)。
AAV腎臟給藥方式
基因表達(dá)分布
特點(diǎn)
腎靜脈注射
皮質(zhì)和髓質(zhì)中表達(dá)，主要在腎小球和近端小管中
難以突破腎小球屏障，效率較低
腎動(dòng)脈注射
近端小管和腎集合管
技術(shù)挑戰(zhàn)性強(qiáng)
腎實(shí)質(zhì)注射
僅限于注射針道周圍
操作相對(duì)簡單
經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射
腎臟管道系統(tǒng)
克服腎小球屏障限制，操作難度大
經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射
皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞中，主要是集合管細(xì)胞
新注射方式，操作簡單，基因表達(dá)穩(wěn)定
下面對(duì)腎靜脈注射、經(jīng)輸尿管逆行注射和經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射三種注射方式進(jìn)行簡單分享：
1. 腎靜脈注射：
①對(duì)C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢(shì)于操作臺(tái)上；
②給小鼠左腹剃毛，在小鼠左腹部做一個(gè)切口，暴露左腎及腎蒂，并將腎靜脈從腎蒂中游離；
③用顯微止血夾夾住腎靜脈遠(yuǎn)端以阻止病毒原液流出腎臟；
④用30G注射針刺入左腎靜脈近端，將50μL液體（含有 5x10 10 個(gè)病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或 PBS）注入腎靜脈；
⑤5min后，拔出注射針，移去顯微止血夾并壓迫止血片刻，將切口分兩層縫合。
2. 經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射：
①對(duì)C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢(shì)于操作臺(tái)上；
②在小鼠左腹部做一個(gè)切口并輕輕剖開，找到輸尿管遠(yuǎn)端和腎動(dòng)脈并用顯微止血夾夾住；
③用 30G注射針刺破輸尿管，將注射針貼合于管壁并固定到位，使用 6-0縫線縫合以防液體泄漏；
④將尿液輕輕吸出，將注射器替換為另一個(gè)含有約 50μL液體（含有 5x10 10 個(gè)病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或PBS）的注射器，并緩慢地將液體逆行注入輸尿管；
⑤將注射針撤出，并在注射部位的近端放置一個(gè)顯微止血夾以防液體泄漏；
⑥5min后，移去輸尿管遠(yuǎn)端、近端及腎動(dòng)脈上的顯微止血夾，用6-0縫線將切口分兩層縫合。
3. 經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射：
①對(duì)C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢(shì)于操作臺(tái)上；
②對(duì)小鼠左腹進(jìn)行剃毛處理，切開一個(gè)2cm的切口暴露左腎和輸尿管，并將周圍器官和脂肪輕輕分開；
③用顯微止血夾夾住輸尿管上段以阻止病毒原液下流至膀胱；
④用30G注射針刺入左腎中極的腎盂（注意注射針頭不應(yīng)刺穿腎盂），將50μL液體（含5x1010個(gè)病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或PBS）注入腎盂；
注：注射針刺入腎盂而不刺穿腎盂的關(guān)鍵在于注意比對(duì)穿刺針和小鼠腎臟，并且在注射針上做好標(biāo)記；
⑤5min后移去顯微止血夾，將切口分兩層縫合。
2.血清型的選擇
腎臟研究中常用的AAV載體有 AAV2、AAV6、AAV8 和AAV9，其中以AAV9型居多。
1. 在腎臟的尾靜脈注射轉(zhuǎn)導(dǎo)中，rAAV8和rAAV9的腎臟轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)錄活性優(yōu)于rAAV2，rAAV9更優(yōu)。
圖3. rAAV2-CMV-GFP、rAAV8-CMV-GFP和rAAV9-CMV-GFP在腎臟中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)錄活性比較
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 6周齡雄性129/Sv小鼠
注射方式： 尾靜脈注射
注射量： 5×10 11 vg
啟動(dòng)子： CMV
數(shù)據(jù)來源于：Combined Paracrine and Endocrine AAV9-mediated Expression of Hepatocyte Growth Factor for the Treatment of Renal Fibrosis.
2. Rocca et al. 利用腎靜脈逆行注射技術(shù)將AAV5, AAV6, AAV8以及AAV9注入小鼠腎臟，不僅證實(shí)腎靜脈逆行注射比尾靜脈注射有更好的腎基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果，而且發(fā)現(xiàn)在四種AAV血清型中， AAV9 更能同時(shí)高效轉(zhuǎn)導(dǎo)皮質(zhì)和髓質(zhì)（AAV6轉(zhuǎn)導(dǎo)髓質(zhì)效果更好，但對(duì)皮質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低），此外，AAV9均能有效靶向腎小球和近端小管且在腎小球內(nèi)效率更高（圖4）。
圖4. 腎靜脈逆行注射rAAV9是腎基因傳遞的有效方式
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 2月齡C57BL/6小鼠
注射方式： 腎靜脈注射
注射量： 100 μL，5×10 10 particles
啟動(dòng)子： CMV
數(shù)據(jù)來源于：rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidneytargeted gene delivery: conclusion of a comparative study.
3.注射量的確定
以小鼠為例，一般情況下，AAV在腎臟中的給藥劑量通常在10E10-10E11VG/只（需要根據(jù)注射方式靈活調(diào)整），根據(jù)病毒實(shí)際滴度，注射體積在50-100μL左右。
4.啟動(dòng)子的選擇
腎臟研究中可以選擇廣譜性啟動(dòng)子CMV，也可以選擇特異性啟動(dòng)子NPHS1，增加腎臟靶向性。
圖5. 載體的組織趨向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測(cè)
（Jason L Picconi et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014）
圖6. NPHS1啟動(dòng)子的腎臟特異性
（Jason L Picconi et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014）
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物： 17周齡C57BL/6懷孕母鼠；
注射方式： 尾靜脈注射
病毒： AAV9-NPHS1-eGFP（White） ；
AAV9-CMV-eGFP（Black）
注射量： 1×10 12 vg/mouse
小結(jié)： AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)腎基因的效率應(yīng)結(jié)合注射方式、血清型及啟動(dòng)子等多方面綜合考慮，建議在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前查閱相關(guān)文獻(xiàn)并進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
5.參考文獻(xiàn)
[1]. van der Wouden, E.A., et al., Approaches and methods in gene therapy for kidney disease. J Pharmacol Toxicol Methods, 2004. 50(1): p. 13-24.
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[5]. Rocca, C.J., et al., rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther, 2014. 21(6): p. 618-28.
[6]. Saito, S., et al., rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol, 2019. 23(12): p. 1345-1356.
[7]. Jing, X., et al., Gene deficiency or pharmacological inhibition of PDCD4-mediated FGR signaling protects against acute kidney injury. Acta Pharm Sin B, 2021. 11(2): p. 394-405.
[8]. Jason L Picconi et al. Kidney-specific expression of GFP by in-utero delivery of pseudotyped adeno-associated virus 9 Mol Ther Methods Clin Dev. 2014; 1: 14014.
AAV在腎臟研究中的案例分享 『應(yīng)用篇』 （可點(diǎn)擊查看）
