IF=8.702｜北京協(xié)和醫(yī)院研究團隊發(fā)現(xiàn)血-睪屏障調(diào)控新機制！
維真生物客戶文章分享-AAV8在睪丸中的應用
文章標題： ALKBH5 in mouse testicular Sertoli cells regulates Cdh2 mRNA translation to maintain blood–testis barrier integrity
發(fā)表期刊： Cellular & Molecular Biology Letters（IF=8.702）
合作客戶： 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院
維真助力：AAV載體
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實驗動物
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雄性C57BL/6J小鼠（2月齡）
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病毒產(chǎn)品
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AAV8-shALKBH5-GFP & AAV8-SC-GFP
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注射部位
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睪丸生精小管
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研究背景
睪丸支持細胞構(gòu)成的血液-睪丸屏障（BTB）對于維持精子產(chǎn)生的獨特微環(huán)境至關(guān)重要。去甲基化酶ALKBH5在小鼠睪丸支持細胞中大量表達，并以m6A依賴的方式調(diào)節(jié)精子產(chǎn)生，但目前尚不清楚ALKBH5是否參與BTB的調(diào)節(jié)。在本研究中作者利用AAV8 -shALKBH5構(gòu)建了睪丸支持細胞特異性ALKBH5敲低小鼠，用以探討ALKBH在BTB中的功能，發(fā)現(xiàn)ALKBH5通過調(diào)控Cdh2 mRNA翻譯來調(diào)節(jié)BTB完整性。
結(jié)果展示
1. 睪丸支持細胞中的ALKBH5參與BTB完整性的調(diào)節(jié)
作者通過前期研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5在小鼠睪丸支持細胞中大量表達，為了闡明支持細胞ALKBH5與BTB之間的聯(lián)系，作者利用AAV8-shALKBH5構(gòu)建了支持細胞ALKBH5特異性敲低小鼠模型，BTB完整性測定表明，ALKBH5敲低小鼠的曲精小管BTB完整性受損，但對照小鼠的曲精小管中BTB未受損，表明支持細胞中的ALKBH5參與BTB完整性的調(diào)節(jié)。
圖1 ALKBH5參與BTB完整性的調(diào)節(jié)
2. ALKBH5調(diào)節(jié)Cdh2 mRNA的m6A水平及其翻譯
ALKBH5主要通過m6A（mRNA N6-腺苷酸甲基化）調(diào)控基因表達，為了研究ALKBH5調(diào)控BTB完整性的機制，作者將小鼠支持細胞TM4中的ALKBH5進行沉默及m6A-seq分析。發(fā)現(xiàn)ALKBH5表達降低后總體m6A水平增加，并鑒定出1416個高甲基化RNA和615個低甲基化RNA，其中一些基因集與形成BTB的細胞骨架相關(guān)。通過進一步的篩選發(fā)現(xiàn)ALKBH5沉默導致Cdh2 mRNA的m6A水平顯著增加，其中Cdh2 mRNA編碼BTB中的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白N-鈣粘蛋白，m6A IP qPCR實驗再次證實這一結(jié)果，此外作者還發(fā)現(xiàn)Cdh2 mRNA與ALKBH5蛋白結(jié)合，表明Cdh2 mRNA是支持細胞中ALKBH5的去甲基化底物。
圖2 Cdh2 mRNA的鑒定
3. ALKBH5通過Cdh2調(diào)節(jié)BTB完整性
多聚體分析結(jié)果表明，沉默ALKBH5后Cdh2 mRNA翻譯效率呈上升趨勢，但沒有觀察到Cdh2 mRNA含量和選擇性剪接方式的變化。因此，作者測定翻譯相關(guān)的m6A結(jié)合蛋白與Cdh2 mRNA之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Cdh2 mRNA和IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3之間存在強烈相互作用，同時Igf2bp1, Igf2bp2及Igf2bp3的沉默均導致N-鈣粘蛋白含量顯著降低，Western blot實驗發(fā)現(xiàn)N-鈣粘蛋白表達在沉默Alkbh5后上調(diào)。這些結(jié)果表明：ALKBH5通過調(diào)節(jié)Cdh2 mRNA的m6A水平，并在IGF2BP1/2/3幫助下影響其翻譯效率。N-鈣粘蛋白是基底內(nèi)質(zhì)特化的重要結(jié)構(gòu)分子，Alkbh5敲除小鼠睪丸中的基底內(nèi)質(zhì)特異性肌動蛋白束嚴重紊亂，表明小鼠睪丸支持細胞中的ALKBH5通過調(diào)節(jié)Cdh2 mRNA翻譯效率，以調(diào)控血液-睪丸屏障的完整性。
圖3 ALKBH5通過Cdh2調(diào)節(jié)BTB完整性
本研究發(fā)現(xiàn)，ALKBH5調(diào)節(jié)小鼠睪丸支持細胞Cdh2 mRNA的m6A水平，影響Cdh2 mRNA翻譯效率，并通過N-鈣粘蛋白參與調(diào)節(jié)基底內(nèi)質(zhì)特化，繼而調(diào)控BTB的完整性。
