AAV在內(nèi)耳的靶向應(yīng)用策略（上）
耳聾是一種常見的感官缺陷疾病之一，位居我國各類殘疾之首，其中60%以上的耳聾由遺傳因素引起，遺傳性耳聾在新生兒中發(fā)生率約為1/500。目前臨床上對(duì)于遺傳性耳聾的治療，主要是通過植入人工耳蝸、佩戴助聽器以及化學(xué)藥物治療，但這些都不能從根本上治療耳聾。近年來，基因治療藥物為常規(guī)方法無法治療的疾病提供了希望，截止2024年9月，全球獲批上市的基因治療藥物共54款（不含DNA和mRNA疫苗），以病毒為載體的基因療法就有16款。AAV載體憑借其高安全性，低免疫原性等優(yōu)勢(shì)，可以安全地轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和感官系統(tǒng)，并在多種疾病的基因治療中顯示出巨大潛力，這為遺傳性耳聾的治愈帶來了新的希望。目前，已有多項(xiàng)研究表明，使用AAV作為基因治療載體可以部分或完全恢復(fù)遺傳性耳聾小鼠模型的聽力。
耳朵結(jié)構(gòu)
耳朵分為外耳、中耳和內(nèi)耳三部分，其中外耳和中耳傳導(dǎo)聲波，內(nèi)耳是聽覺和位覺感受器。在結(jié)構(gòu)上，外耳包括耳廓和外耳道，中耳由鼓膜、鼓室及聽骨鏈組成，內(nèi)耳位于顳骨巖部內(nèi)，包括半規(guī)管、前庭和耳蝸（cochlea）。值得注意的是，大多數(shù)引起耳聾的基因主要在耳蝸內(nèi)的細(xì)胞中表達(dá)，因此，AAV介導(dǎo)的針對(duì)聽力損失的基因療法一般都集中于靶向耳蝸結(jié)構(gòu)。
哺乳動(dòng)物的耳蝸內(nèi)含有兩種類型的毛細(xì)胞（Hair Cells, HCs）：內(nèi)毛細(xì)胞(IHCs)和外毛細(xì)胞(OHCs)，這兩種毛細(xì)胞對(duì)聽覺信號(hào)的檢測(cè)和處理至關(guān)重要，成熟的哺乳動(dòng)物毛細(xì)胞不能再生，因此這些細(xì)胞一旦發(fā)生損傷，其退化過程往往是不可逆的。支持細(xì)胞(Supporting cells, SCs)圍繞在毛細(xì)胞外周，對(duì)耳蝸內(nèi)穩(wěn)態(tài)十分重要，引起先天性耳聾的GJB2基因即在支持細(xì)胞中表達(dá)。螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（Spiral Ganglion Neurons, SGNs）是聽覺系統(tǒng)的一級(jí)神經(jīng)元，在聽覺傳導(dǎo)過程中起重要作用。
此外，由毛細(xì)胞、支持細(xì)胞及其它附屬結(jié)構(gòu)構(gòu)成了Corti器（柯蒂氏器），Corti器周圍是充滿外淋巴管的前庭階（Scala vestibuli）、鼓階（Scala tympani）以及充滿內(nèi)淋巴管的蝸管（Scala media）。
圖1. 耳朵結(jié)構(gòu)分析
（https://www.audiocure.com/inner-ear-disorders/）
（Peters CW, et al. Trends Pharmacol Sci. 2021）
AAV靶向內(nèi)耳策略
1、啟動(dòng)子選擇
· 組成型啟動(dòng)子
CMV和CBA已被證明可驅(qū)動(dòng)耳蝸毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，Pgk1（磷酸甘油酸激酶1）啟動(dòng)子則可驅(qū)動(dòng)外源基因在支持細(xì)胞中表達(dá)。
圖2. CMV、CBA和Pgk1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在離體培養(yǎng)小鼠耳蝸細(xì)胞中的表達(dá)
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
· 特異性啟動(dòng)子
Syn1（突觸素1）啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)外源基因在耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，Myo7a（人肌球蛋白ⅦA）、Pou4f3（POU結(jié)構(gòu)域第4類轉(zhuǎn)錄因子3）和Slc26a5（溶質(zhì)載劑家族26成員5）是轉(zhuǎn)導(dǎo)毛細(xì)胞的可選啟動(dòng)子，使用時(shí)應(yīng)考慮AAV的包裝容量。
圖3. Syn1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因在離體培養(yǎng)小鼠耳蝸耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的表達(dá)
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
2、注射方式選擇
應(yīng)用于內(nèi)耳的注射方式主要有：圓窗膜（RWM）注射、耳蝸造口術(shù)（Cochleostomy）、后半規(guī)管(PSCC)注射及胞囊（Utricle）注射。
·圓窗膜（RWM）注射是新生小鼠以及非人靈長類動(dòng)物（NHPs）中常用的方法，載體可傳送至耳蝸鼓階的外淋巴。該注射方法對(duì)內(nèi)耳外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率相對(duì)有限。
·后半規(guī)管(PSCC)注射能使病毒載體有效地感染新生小鼠耳蝸和前庭器官的細(xì)胞。該方法同樣具有侵入性，可能會(huì)有損傷毛細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。
·耳蝸造口術(shù)（Cochleostomy）涉及穿透側(cè)壁，一般在成年受試者耳蝸骨鈣化后使用，載體可輸送至蝸管的內(nèi)淋巴。該方法具有侵入性，可能會(huì)有損傷毛細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)，造成聽力損害。
·胞囊注射可能會(huì)使載體傳遞至內(nèi)淋巴，已被證明可在耳蝸中實(shí)現(xiàn)多種AAV血清型的高水平表達(dá)，研究表明在相同血清型、啟動(dòng)子、病毒滴度及注射體積條件下，胞囊注射方法在新生小鼠內(nèi)耳IHCs和OHCs中的轉(zhuǎn)導(dǎo)率均略高于RWM注射法。
圖4. 耳蝸內(nèi)的不同注射途徑
（Maguire CA, et al. Hear Res. 2020）
下面介紹圓窗膜（RWM）注射、后半規(guī)管（PSCC）注射和耳蝸造口術(shù)注射方式的操作步驟：
1、圓窗膜（RWM）注射
1) 腹腔注射氯胺酮(100mg /kg)、甲苯噻嗪(10mg /kg)和乙酰丙嗪(2mg /kg)混合物麻醉小鼠，確保小鼠對(duì)疼痛刺激（如腳趾夾）無反應(yīng)后，才能開始手術(shù)準(zhǔn)備；
2) 在小鼠眼睛上涂抹保護(hù)性的藥膏，使其在麻醉期間保持眼睛濕潤，并抑制眨眼反射；
3) 在整個(gè)過程中，將小鼠的頸部伸展放在加熱墊上，直到小鼠完全清醒，以防止麻醉后體溫過低；
4) 用剃刀刮掉小鼠耳后的毛發(fā)，并用70%乙醇和聚維酮碘消毒；
5) 在外耳下方做一個(gè)切口，將軟組織推開，露出鼓室大皰；
6) 用25G針在鼓室大皰上穿孔，然后充分?jǐn)U大以可見鐙骨動(dòng)脈（SA）和圓窗膜(RWM)；
7) 用硼硅酸鹽毛細(xì)管移液管在RWM中心輕輕穿刺，觀察液體通過RWM的流出情況(耳蝸流出的液體用無菌濾紙干燥)；
8) 在射流穩(wěn)定后(5-10 min)，將0.6~2μL的AAV載體通過RWM注射到耳蝸鼓階；
9) 拔出移液管后，用一小塊肌肉組織迅速密封RW龕，并在肌肉上滴一小滴組織膠固定，以避免耳蝸周圍淋巴液通過RWM滲漏；
10) 注射完畢后，用脂肪組織覆蓋大皰孔，將耳后肌和脂肪組織恢復(fù)正常位置，用6-0或更小的可吸收鉻線分層縫合傷口，并作消毒處理；
11) 把小鼠放在一個(gè)溫暖干凈的籠子里觀察看護(hù)，待其完全恢復(fù)；
12) 術(shù)后皮下注射卡洛芬（2 mg/kg）進(jìn)行鎮(zhèn)痛，此后每24小時(shí)注射一次，持續(xù)3天，以控制炎癥和疼痛。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物是否有痛苦、體重異常減輕、疼痛或感染的跡象。一般情況下，所有小鼠在手術(shù)后第三天應(yīng)能正常活動(dòng)。
圖5. 圓窗膜（RWM）注射
（Akil O, et al.Methods Mol Biol. 2019）
2、后半規(guī)管（PSCC）注射
1) 通過腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(20 mg/kg)麻醉小鼠；
2) 用剃刀刮掉小鼠左耳后的毛發(fā)，并用10%聚維酮碘消毒；
3) 對(duì)耳后皮膚做一個(gè)15mm的切口，解剖暴露面神經(jīng)及胸鎖乳突肌后，切除近端部分肌肉；
4) 使用4-0 vicryl縫合線將覆蓋顳骨的肌肉分離并向背側(cè)收回，露出后半規(guī)管的骨壁，清晰可見為一條深色條紋；
5) 使用26號(hào)皮下注射針在后半規(guī)管附近扎一個(gè)小孔，等待5min，待外淋巴液滲漏減輕后，將聚酰亞胺管的尖端以貼近壺腹部的方式插入后半規(guī)管中；
6) 聚酰亞胺管與小孔之間的縫隙用肌肉碎片和氰基丙烯酸酯膠密封，通過無液體泄漏直觀評(píng)估密封的嚴(yán)密性；
7) 將250 nL的病毒懸液以100 nL/min的速度在2.5 min內(nèi)注入后半規(guī)管中，注射后將試管留在后半規(guī)管中靜置5min；
8) 取出管子后，用小塊肌肉堵住小孔，并涂上氰基丙烯酸酯膠水，最后用5-0尼龍縫合線縫合傷口；
9) 把小鼠放在一個(gè)溫暖干凈的籠子里，待其完全恢復(fù)。
圖6. 后半規(guī)管（PSCC）注射
（Suzuki J, et al. Sci Rep. 2017）
3、耳蝸造口術(shù)
1) 通過腹腔注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）麻醉小鼠；
2) 對(duì)小鼠右耳后區(qū)域進(jìn)行剃毛，并用10%聚維酮碘消毒；
3) 在手術(shù)顯微鏡下，于耳后做一個(gè)長約10 mm的切口，提取右側(cè)耳廓及胸鎖乳突肌，暴露位于顳骨邊緣的PSCC；
4) 用波恩微型探針在PSCC上鉆一個(gè)小孔，等待幾分鐘，直到?jīng)]有明顯的外淋巴液流出；
5) 將聚酰亞胺管的尖端插入PSCC中，并使用組織粘合劑密封小孔，確保沒有外淋巴液流出；
6) 利用MICRO4微量注射控制器控制聚酰亞胺管進(jìn)行病毒注射，速率179nL/min，每次注射病毒總體積為1 μL或2 μL，時(shí)間控制在5-10min；
7) 注射后切斷聚酰亞胺管，留下約5mm與PSCC相連。用組織粘合劑密封殘留的管孔，然后用5-0 Ethilon線縫合皮膚；
8) 把小鼠放在一個(gè)溫暖干凈的籠子里觀察看護(hù)，待其完全恢復(fù)。
以上是關(guān)于AAV在內(nèi)耳應(yīng)用中的啟動(dòng)子和注射方式的選擇策略，下期我們將繼續(xù)分享內(nèi)耳應(yīng)用中AAV血清型和載體的選擇，敬請(qǐng)期待~
