如何正確閱讀載體圖譜？
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基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強(qiáng)有力的生物工具，我們先來認(rèn)識和閱讀載體圖譜吧。
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一、載體分類及載體組成元件
載體分類
1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體
病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入目的細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機(jī)制?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：
（1）攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；
（2）介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá)；
（3）對人體不致?。?/span>
（4）在環(huán)境中不會引起增殖和傳播。
非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA。
2、按進(jìn)入受體細(xì)胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體（含原核和真核2個復(fù)制子，能在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制，并可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)）。
3、按功能分類：克隆載體、表達(dá)載體
克隆載體：具有克隆載體的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以攜帶DNA片段或外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并克隆和大量擴(kuò)增DNA片段（外源基因）的載體。
表達(dá)載體：克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控（具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序）有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。
載體組成元件
1、復(fù)制起始位點Ori：即控制復(fù)制起始的位點。Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向（正向）。
2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+
（1）Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
（3）camr：生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。
（5）hygr：使潮霉素β失活。
3、多克隆位點：MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入，會導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10kb的外源DNA片段。一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。
4、P/E：啟動子/增強(qiáng)子
5、Terms：終止信號
6、加poly（A）信號：可以起到穩(wěn)定mRNA作用
示例閱讀載體：
pENTER載體
1）human ORF + pENTER載體
2） CMV啟動子，T7啟動子
3） ORF的C端融合了Flag和His tag
4) 多克隆位點，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的)
4） SV40 poly（A）加尾信號
5） SV40啟動子啟動的puro標(biāo)記
6） 2個腺病毒ITR序列和2個與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接用于腺病毒的生產(chǎn)。
慢病毒載體
1）EF1a啟動目的基因（可添加小標(biāo)簽FLAG或HIS等小標(biāo)簽）
2）CMV啟動GFP，非融合抗性篩選標(biāo)記Puro（便于做細(xì)胞株的穩(wěn)篩）
3）WPRE（來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件），放置在目的基因的上游，能加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)
4) cPPT（來自HIV-1整合酶基因），增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度
5）第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ 包裝 信號和LTR 長末端重復(fù)序列，其中3’LTR增強(qiáng)子功能缺失，5’LTR中U3區(qū)替代為CMV，更加安全的病毒載體)
腺相關(guān)病毒載體
AAV表達(dá)載體包括了中兩個ITR + CMV（可替換其他組織特異性啟動子，見改造載體部分）+ globin intron 內(nèi)含子序列 + 目的基因 + poly A序列
二、選擇和準(zhǔn)備載體
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時還要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點等。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點以實驗?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
載體選擇主要考慮下述3點：
1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
2、載體的類型：
（1）克隆載體的克隆能力—據(jù)克隆片段大?。ù筮x大，小選?。Ｓ绕鋵τ诓《据d體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。
①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。
②慢病毒的包裝容量約為6kb（包含載體帶有的其他抗性基因或報告基因），但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會下降1個單位數(shù)量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進(jìn)行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作為受體、轉(zhuǎn)運蛋白行使功能）等由于其本身的功能，包裝可能會有一定難度。
③AAV的總包裝容量是4.7 kb（包含載體中兩個ITR約0.3kb +具體啟動子 + 內(nèi)含子約0.6kb + 具體熒光標(biāo)簽 + polyA約0.2kb），所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內(nèi)含子，因為內(nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。
（2）確定表達(dá)蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達(dá)質(zhì)粒。一般分為原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達(dá)載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達(dá)載體一般是細(xì)胞、體內(nèi)表達(dá)等需要時所用，只需要將它放到細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞即可，唯一考慮的是它的啟動子的選擇，常用都是cmv啟動子的，表達(dá)效率較高，也有多種啟動子經(jīng)過改造的表達(dá)載體，一般用來表達(dá)需要調(diào)控表達(dá)時間及表達(dá)量的蛋白。
3、載體MCS中的酶切位點數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯位。
①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1-1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；
②一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個；
③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地；
④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。
選擇載體還需注意：
無標(biāo)簽載體，起始/終止密碼子都要添加！
標(biāo)簽在N端的載體，終止密碼子要添加！
標(biāo)簽在C端的載體，起始密碼子要添加！
（詳細(xì)解讀如下）
①對于無起始密碼子和終止密碼子的基因，插入無標(biāo)簽的載體要加入起始密碼子和終止密碼子。
②載體N端有標(biāo)簽，上游引物要對讀碼框；下游引物要加終止密碼子(為了保證基因的表達(dá),少翻譯載體序列) 。
鏈接：對讀碼框是為了防止移碼，是不是移碼要看載體圖譜，看酶切位點。從ATG開始，要保證三個堿基編碼的氨基酸不能影響插入目的基因的正常編碼，若影響了插入目的基因的正常編碼就要在設(shè)計引物的時候在酶切位點前或者后插入一個或者兩個堿基，總之是不能影響插入目的基因的正常編碼蛋白。有的酶切位點含有起始密碼子，如果標(biāo)簽在C端像Nco I就有一個ATG，這時候需要加堿基在酶切位點后面。
③載體C端有標(biāo)簽，上游引物要加起始密碼子，且考慮是否加Kozak序列（真核表達(dá)系統(tǒng)）；下游引物要對讀碼框，并且要去掉基因本身的終止密碼子（保證C端標(biāo)簽表達(dá)）。
鏈接：Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC（常見的序列是GCCACC），位于起始密碼子（ATG）之前。它可以與翻譯起始因子結(jié)合而介導(dǎo)含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始。在真核生物中，該序列相對比較保守。對應(yīng)于原核生物的SD序列（原核基因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游一段對mRNA的翻譯起作用的序列）。
添加Kozak序列的好處：核糖體需要Kozak序列進(jìn)行穩(wěn)定結(jié)合有助于提高真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。
三、改造載體
1、改造啟動子：一般在過表達(dá)載體中CMV屬于廣譜型的強(qiáng)啟動子，具體可根據(jù)實驗需求，選用不同啟動子，尤其是對于AAV載體構(gòu)建時選用組織特異性啟動子。
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啟動子名稱
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啟動子大小
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組織特異性
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ALB
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2.4kb
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肝臟特異性
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CAG
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944bp
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廣泛表達(dá)的強(qiáng)啟動子
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CamKIIa
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1.2kb
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大腦皮層和海馬神經(jīng)元特異性啟動子
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CMV
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0.6kb
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廣泛表達(dá)的強(qiáng)啟動子
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EF1A
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1.2kb
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廣泛表達(dá)的啟動子(尤其在體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá))
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GFAP
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1.0kb
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星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子
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aMHC
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0.4kb
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心肌α肌球蛋白重鏈啟動子
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cTNT
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702bp
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心肌特異性
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Synapsin
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471bp
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成熟神經(jīng)元特異性啟動子
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Rpe65
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700bp
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視網(wǎng)膜特異性
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3Xenhancer McK
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728bp
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小鼠中肌肉特異性啟動子
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NSE
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1.3kb
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神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動子
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2、實驗?zāi)康牡男枰?/strong>
①構(gòu)建過表達(dá)or干擾載體
根據(jù)實驗用途選擇載體，如過表達(dá)載體通常選用CMV啟動子，CMV因其集中了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點而具有異常高的活性，是公認(rèn)的真核表達(dá)中的增強(qiáng)子，一般插入某個基因的CDS區(qū)到CMV啟動子下游，CMV負(fù)責(zé)啟動該基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)高該基因表達(dá)的作用；而U6和H1更多的是用于shRNA的啟動來達(dá)到敲低一個基因的作用，U6和H1啟動子都是RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子，其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)約21個核苷酸和約50個核苷酸莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop），RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ到連續(xù)4個或5個T時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會停止。
我們公司的shRNA病毒載體（包括腺病毒載體、慢病毒載體和腺相關(guān)病毒載體）是由U6或H1 啟動shRNA 實現(xiàn)，并連接了報告基因，可以實時監(jiān)測載體的轉(zhuǎn)染效率。構(gòu)建干擾載體針對目的基因（目的基因需要大于0.7kb，若小于0.7kb需要評估來確保能設(shè)計出8條shRNA序列），設(shè)計并提供4個針對靶基因的shRNA產(chǎn)品，確保4個shRNA中的1個產(chǎn)品在細(xì)胞感染效率達(dá)80%以上的前提下，在mRNA水平至少有70%的沉默效果；也可以按照客戶的要求來設(shè)計，由客戶確定shRNA 序列的長度，對于每條選定的靶序列，設(shè)計正義鏈和反義鏈，以 loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)相連，合成shRNA。
②是否攜帶GFP等熒光標(biāo)簽
攜帶熒光標(biāo)簽基本目的是為了觀察感染目的細(xì)胞的效率；攜帶該標(biāo)簽的好處之一是不用破碎組織細(xì)胞和不加任何底物，直接通過熒光顯微鏡就能在活細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，實時顯示目的基因的表達(dá)及定位情況，而且熒光性質(zhì)穩(wěn)定。但是，由于GFP標(biāo)簽比較大（約720bp），這種大標(biāo)簽在位置上對目的基因造成了空間位阻作用，對蛋白的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，從而不利于目的基因蛋白本身的活性及正常功能的發(fā)揮。此外，還需要結(jié)合蛋白本身的特性，比如該蛋白為具有切割活性的蛋白，即使融合了GFP，標(biāo)簽很有可能會被破壞，終究會影響GFP的熒光及基本功能。一般不建議融合這么大的標(biāo)簽，實驗需要帶熒光標(biāo)簽，建議構(gòu)建載體時通過P2A非融合。
③是否融合6×His、HA、Myc、FLAG等小標(biāo)簽
為了做免疫共沉淀實驗或者WB檢測蛋白表達(dá),需要加融合小標(biāo)簽。多數(shù)情況下,由于多肽標(biāo)簽相對較小，對目的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小。但是在蛋白合成肽鏈的過程中，如果影響了蛋白的折疊，也會造成目的蛋白活性的下降甚至功能的喪失。
④是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動子－核糖體結(jié)合位點－克隆位點－轉(zhuǎn)錄終止信號。
鏈接：啟動子：促進(jìn)DNA轉(zhuǎn)錄的DNA序列，這個DNA區(qū)域常在基因或操縱子編碼區(qū)的上游，是DNA分子上可以與RNA聚合酶特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。
增強(qiáng)子：為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序，其作用與其所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。
沉默子：負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。
核糖體結(jié)合位點/SD序列：mRNA的起始AUG上游約8~13核苷酸處，存在一段由4~9個核苷酸組成的共有序列，可被16SrRNA通過堿基互補(bǔ)精確識別的序列被稱為核糖體結(jié)合位點/SD序列是對原核生物而言，在mRNA 5’ 端起始密碼子AUG上游一段對mRNA的翻譯
起作用的序列。
轉(zhuǎn)錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點下游有一段GT或T富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成poly（A）加尾信號。
3、載體中P2A和IRES的選擇：
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IRES 和 P2A 的比較
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IRES
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P2A
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定義
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IRES內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點序列：是一段約500bp的核酸序列，這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與RNA結(jié)合，能獨立的起始蛋白翻譯。
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P2A肽(2A peptide)是一種可"自我剪切"的短小肽鏈，最初在FMDV中發(fā)現(xiàn)，約22個氨基酸，2A肽可在蛋白翻譯時通過核糖體跳躍從自身最后2個氨基酸C末端斷裂。
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優(yōu)點
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IRES被放置于兩個ORF之間的時候，可以同時表達(dá)這兩個ORF。由于兩個ORF分別有自己的起始密碼子和終止密碼子，所以會翻譯兩個獨立的、沒有經(jīng)過修飾的蛋白。
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兩個基因（ORF）通過2A多肽鏈連接成為一個ORF，mRNA翻譯成一個融合蛋白，但這兩個融合蛋白會被識別2A的蛋白酶切成兩個蛋白。這兩個蛋白的摩爾比理論上是1:1。
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缺點
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IRES的存在有時候會影響mRNA的結(jié)構(gòu)，同時由于IRES和mRNA的5’CAP對核糖體/或翻譯起始復(fù)合物的結(jié)合力不同，IRES后面的ORF翻譯蛋白的水平有可能與IRES前面的ORF蛋白水平不一致。有的時候前面的ORF表達(dá)很好，但后面的ORF表達(dá)水平不高；有的時候后面的ORF和/或IRES會影響前面ORF的表達(dá)，甚至前面的ORF根本不表達(dá)。
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2A是一個大約22個氨基酸的多肽。蛋白酶切割會發(fā)生在2A多肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之間。所以，前一個蛋白的尾巴上會留下一個20多個氨基酸的多肽。后面一個蛋白的N端會留下一個多余的脯氨酸。尤其是第一個蛋白，如果是一個小分子（比如分泌型的細(xì)胞因子），可能其功能會受到這20多個氨基酸的影響。
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建議
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IRES序列后基因的表達(dá)效率顯著低于IRES序列前基因的表達(dá)，所以與IRES相比，2A肽具有以下優(yōu)點：（1）2A序列短，能夠有效地實現(xiàn)連接基因之間的共表達(dá)；（2）位于2A下游的基因同樣可以獲得很高的表達(dá)水平。
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四、影響載體選擇的因素：
? 原核表達(dá) or 真核表達(dá)
? 細(xì)胞實驗 （過表達(dá) or 干擾、瞬時表達(dá) or穩(wěn)轉(zhuǎn)株、基因大小、熒光、藥篩 ）
?動物實驗 （過表達(dá) or 干擾、注射部位、基因大小、觀察周期 ）
