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1.研究背景
人類大腦約有860億個神經(jīng)元,這些神經(jīng)元由數(shù)萬億個突觸連接在一起。神經(jīng)元的主要功能是接收、整合和傳遞信息。它們通過電化學(xué)信號進(jìn)行交流,并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),從而控制動物的認(rèn)知和行為。
神經(jīng)科學(xué)研究的重點,就是從細(xì)胞和分子水平了解神經(jīng)元如何相互連接和交流,這對于解析動物認(rèn)知和行為背后的神經(jīng)環(huán)路具有重大意義。興奮是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的方式,神經(jīng)纖維受到刺激后,膜內(nèi)外電位會產(chǎn)生一系列變化而產(chǎn)生興奮,興奮產(chǎn)生后先在同一個神經(jīng)元上以動作電位的形式傳導(dǎo),興奮跨過突觸間隙時通過電化學(xué)信號的轉(zhuǎn)變,再傳遞到下一個神經(jīng)元。
突觸處有兩種類型的化學(xué)信使,神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。神經(jīng)遞質(zhì)通過突觸間隙擴(kuò)散,特異地作用于突觸后細(xì)胞上的受體,從而完成信息傳遞功能。而神經(jīng)調(diào)質(zhì)則與突觸后細(xì)胞上的受體結(jié)合后,增強(qiáng)或削弱遞質(zhì)的效應(yīng),從而調(diào)節(jié)突觸信息傳遞。例如,谷氨酸和γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合突觸后細(xì)胞上的受體后,可以迅速地使突觸后神經(jīng)元去極化或超極化,進(jìn)而直接調(diào)控這些神經(jīng)元的活動。對于神經(jīng)調(diào)質(zhì),它們大多與GPCRs結(jié)合后誘發(fā)突觸前或突觸后電位,不直接引起突觸后生物學(xué)效應(yīng),但能調(diào)節(jié)遞質(zhì)在突觸前的釋放及突觸后細(xì)胞的興奮性,調(diào)節(jié)突觸后細(xì)胞對遞質(zhì)的反應(yīng)。
操控和檢測神經(jīng)元之間的交流是神經(jīng)科學(xué)研究的主要手段,許多遺傳工具已經(jīng)被開發(fā)出來,這些遺傳工具通過腺相關(guān)病毒(AAV)等病毒載體用于神經(jīng)環(huán)路的操控和成像。目前,光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)工具被用來直接操控突觸前神經(jīng)元動作電位的產(chǎn)生,鈣成像用于檢測突觸后神經(jīng)元內(nèi)的信號傳遞。然而,高靈敏度、高特異性和高時空分辨率的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測技術(shù)還不成熟。
傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)檢測技術(shù),主要是通過微透析對腦脊液進(jìn)行采樣并生化監(jiān)測、通過碳纖電極進(jìn)行記錄,這些檢測手段各自存在諸多弊端,例如特異性差、靈敏度低和時空分辨率差,難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實動態(tài)信息等。為了解決這一系列的問題,眾多神經(jīng)科學(xué)家一直在致力于優(yōu)化已有的方法或者開發(fā)新的技術(shù),以求彌補(bǔ)短板,取得突破。
2.開發(fā)&原理
自2018年起,北京大學(xué)李毓龍教授課題組通過偶聯(lián)GPCR和循環(huán)重排熒光蛋白cpFP開發(fā)出了很多檢測神經(jīng)遞質(zhì)的可遺傳編碼的熒光探針。神經(jīng)遞質(zhì)與GPCR的結(jié)合會引起后者構(gòu)象的改變,而這種變化又會引起cpFP發(fā)生構(gòu)象改變,進(jìn)而影響其發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境,最終導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度的改變,這種熒光變化可以通過熒光顯微鏡檢測到(Fig 1a和1b)。這些可遺傳編碼的熒光探針被命名為GRAB(GPCR Activation-Based)探針,用于以較高的時空分辨率在體檢測神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。
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Fig1a:綠色神經(jīng)遞質(zhì)探針(cpEGFP-based)的工作原理 | Fig1b:紅色神經(jīng)遞質(zhì)探針(cpmApple-based)的工作原理 |
3.探針特征(已發(fā)表)
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探針名稱 |
所檢測神經(jīng) |
版本 |
顏色 |
骨架 |
親和力 |
信號響應(yīng)幅度 |
動力學(xué) |
下游 |
參考 |
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Ach2.0 |
乙酰膽堿 |
第一代 |
綠色 |
人M3受體 |
EC50~1uM |
ΔF/F0~90% |
τon~200ms, |
弱偶聯(lián) |
[8] |
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Ach3.0 |
乙酰膽堿 |
第二代 |
綠色 |
人M3受體 |
EC50~2uM |
ΔF/F0~280% |
τon~112ms, |
幾乎不偶聯(lián) |
[3] |
![]() |
Ach3.0-mut |
乙酰膽堿 |
第二代對照 |
綠色 |
人M3受體 |
EC50~0uM (W200A突變) |
ΔF/F0~1.8% |
- |
- |
[3] |
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DA1m |
多巴胺 |
第一代 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~130nM |
ΔF/F0~90% |
τon~60ms, |
幾乎不偶聯(lián) |
[7] |
![]() |
DA1h |
多巴胺 |
第一代 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~10nM |
ΔF/F0~90% |
τon~140ms, |
幾乎不偶聯(lián) |
[7] |
![]() |
DAmut(1st) |
多巴胺 |
第一代對照 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~0uM C118A和S193N突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
[7] |
![]() |
DA2m(DA4.4) |
多巴胺 |
第二代 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~90nM |
ΔF/F0~340% |
τon~40ms, |
非常小的偶聯(lián) |
[2] |
![]() |
DA2h(DA4.3) |
多巴胺 |
第二代 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~7nM |
ΔF/F0~280% |
τon~50ms, |
非常小的偶聯(lián) |
[2] |
![]() |
DAmut(2nd) |
多巴胺 |
第二代對照 |
綠色 |
人D2受體 |
EC50~0uM C1183.36A和S1935.42N突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
[2] |
![]() |
rDA1m (rDA2.5m) |
多巴胺 |
- |
紅色 |
人D2受體 |
EC50~95nM |
ΔF/F0~150% |
τon~80ms, |
非常小的偶聯(lián) |
[2] |
![]() |
rDA1h (rDA2.5h) |
多巴胺 |
- |
紅色 |
人D2受體 |
EC50~4nM |
ΔF/F0~100% |
τon~60ms, |
非常小的偶聯(lián) |
[2] |
![]() |
rDAmut (rDA2.5mut) |
多巴胺 |
對照 |
紅色 |
人D2受體 |
EC50~0uM C1183.36A和S1935.42N突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
[2] |
![]() |
NE1m(NE2.1) |
去甲腎上腺素 |
- |
綠色 |
人a2A受體 |
EC50~930nM |
ΔF/F0~230% |
τon ~70ms, |
不偶聯(lián) |
[6] |
![]() |
NE1h(NE2.2) |
去甲腎上腺素 |
- |
綠色 |
人a2A受體 |
EC50~83nM |
ΔF/F0~130% |
τon ~30ms, |
不偶聯(lián) |
[6] |
![]() |
NEmut |
去甲腎上腺素 |
對照 |
綠色 |
人a2A受體 |
EC50~0uM S5.46A突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
[6] |
![]() |
Ado1.0 |
腺苷 |
- |
綠色 |
人A2A受體 |
EC50~60nM |
ΔF/F0~130% |
τon~36ms, |
幾乎不偶聯(lián) |
[4] |
![]() |
Ado1.0mut |
腺苷 |
對照 |
綠色 |
人A2A受體 |
EC50~0uM F168A突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
|
![]() |
5-HT1.0 |
五羥色胺 |
- |
綠色 |
人5-HT2C |
EC50~22nM |
ΔF/F0~250% |
τon~0.2s, |
不偶聯(lián) |
[1] |
![]() |
5-HTmut |
五羥色胺 |
對照 |
綠色 |
人5-HT2C |
EC50~0uM D1343.32Q突變 |
無效應(yīng) |
- |
- |
[1] |
4.探針資源
在李教授組的授權(quán)下,山東維真生物可以出售這些探針的病毒產(chǎn)品(AAV產(chǎn)品為主),以幫助神經(jīng)科學(xué)工作者在體內(nèi)檢測乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、腺苷(Ado)、腺苷三磷酸(ATP)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、精氨酸血管加壓素(AVP)、催產(chǎn)素(OXT)、生長激素抑制素(SST)、神經(jīng)降壓肽(NTS)、內(nèi)源性大麻素(eCB)、大麻素(AEA)和褪黑素(MT)等各種遞質(zhì)的動態(tài)變化,歡迎大家點擊“AAV工具” 中的“神經(jīng)遞質(zhì)探針”進(jìn)行選購!?。?
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5.探針載體獲取
以上所述所有GRAB探針均由北京大學(xué)李毓龍組研發(fā)或聯(lián)合開發(fā)。部分探針已經(jīng)發(fā)表,部分探針尚未發(fā)表。李毓龍組不僅開發(fā)了這些探針,還開發(fā)了這些探針的Cre依賴和突變版本,包括紅色和綠色的熒光信號,以滿足神經(jīng)科學(xué)工作者多樣化的實驗需求。此外,為了提升探針的性能,這些探針還在持續(xù)優(yōu)化中,不斷更新迭代。
以上探針均由維真生物協(xié)助提供。其中已發(fā)表的探針(產(chǎn)品編號中含PUB的病毒為文章中所用病毒),維真生物均有現(xiàn)貨,當(dāng)天上午下單,下午/次日即可發(fā)貨;若由于產(chǎn)品脫銷無庫存,1-2周即可完成入庫并發(fā)貨;您可以通過公司技術(shù)熱線400-077-2566訂購。
如若您對未發(fā)表的探針或者探針序列感興趣,您也可通過上述方式與我們聯(lián)系,,我們將在第一時間幫您與李教授組溝通,征得李教授組的同意之后,我們也可以出售給您。
6.探針病毒使用
由于血腦屏障的存在,普通的注射方式很難實現(xiàn)病毒在腦區(qū)較高且特異性的表達(dá),因此研究者通常需要借助腦立體定位儀將探針病毒注射至特定腦區(qū)(詳見Fig 2),以感染全腦和局部腦區(qū)。
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Fig2:腦立體定位注射的示意圖
(Van der Perren, A., et al, V. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016)
腦立體定位注射的詳細(xì)步驟如下:
1. 實驗動物稱重,進(jìn)行麻醉;
2. 待實驗動物完全麻醉后,用剃毛器將動物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發(fā)剃除干凈;
3. 將麻醉后的實驗動物固定于腦立體定位儀上,具體操作為:實驗動物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護(hù)其雙眼;將門齒掛在門齒掛鉤上,確保頭部保持固定;檢查左右耳桿是否在同一水平上,將左右耳桿通過外耳道插入實驗動物耳內(nèi)。實驗動物固定好的標(biāo)準(zhǔn)為:鼻對正中,頭部不動,提尾不掉,目測大腦放置水平;
4. 手術(shù):用碘伏對實驗動物頭皮進(jìn)行消毒清理,用手術(shù)刀沿中間位置剪開頭皮,用鑷子對表面的結(jié)締組織進(jìn)行清理,暴露實驗動物的顱骨表面;然后進(jìn)行調(diào)平,首先找到前囟這個坐標(biāo),并將其歸零,然后向左右調(diào)平,使左右兩側(cè)處于同一水平,調(diào)整前后囟,使前后囟也在同一水平。
5.病毒注射:通過查詢實驗動物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區(qū)的位置(Fig 3a和3b是大鼠和小鼠的腦譜),并確定其坐標(biāo)值,即ML值(X軸)、AP值(Y軸)、DV值(Z軸);根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)設(shè)定好坐標(biāo),移開注射針,用顱骨鉆開窗(由于顱骨薄,故務(wù)必注意顱骨鉆的力度?。。僮鲿r避免傷及腦組織;微量注射器吸取病毒液,隨后固定在定位儀上,根據(jù)設(shè)好的坐標(biāo)進(jìn)行病毒注射,注射速度控制在0.1-0.15μl/min,注射劑量視具體實驗而定。注射完畢,留針10min,以便病毒液充分吸收,然后慢慢回針。
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Fig3a:The Rat Brain | Fig3b:The Mice Brain |
6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動物蘇醒后, 正常喂養(yǎng), 病毒注射后2-4周可檢測轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
7.常見問題解答
7.1 使用探針AAV病毒注射時,我該使用多大的病毒量?
考慮到病毒批次間的差異,我們建議您直接注射未稀釋的病毒原液200-400nl/site。
7.2 神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中是否能像在小鼠中一樣表達(dá)得很好?
神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中也可以很好地工作。根據(jù)李教授組已發(fā)表的論文,這些探針可以用在多種有機(jī)體中,包括果蠅、斑馬魚、老鼠和斑馬雀等。
7.3 你們是否也有廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的探針AAV病毒?
有些探針在開發(fā)時已構(gòu)建了廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的載體,如CAG,EFs,EF1α,CamKIIα,GfaABC1D和TRE等,具體可以參考探針資源部分的表2。當(dāng)然,如果您對其他組織特異性啟動子感興趣,請參考我們的組織特異性啟動子列表(見下表)來選擇您感興趣的啟動子。如果您找不到想用的啟動子,可以聯(lián)系我們。
組織 |
啟動子名稱 |
啟動子 |
啟動子 |
啟動子描述 |
啟動子應(yīng)用 |
神經(jīng) |
hSyn |
471bp |
人源 |
突觸蛋白1啟動子 |
神經(jīng)元特異性啟動子 |
CamKIIa |
1.2kb |
小鼠 |
鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II α啟動子 |
大腦新皮質(zhì)和海馬興奮性神經(jīng)元特異性啟動子 |
|
c-fos |
1.7kb |
小鼠 |
c-fos基因啟動子 |
興奮性神經(jīng)元啟動子 |
|
Mecp2 |
230bp |
小鼠 |
甲基 CpG 結(jié)合蛋白 2啟動子 |
短的神經(jīng)元特異性啟動子 |
|
NSE |
1.3kb |
小鼠 |
烯醇化酶啟動子 |
神經(jīng)元特異性啟動子 |
|
Somatostat(SST) |
1.2kb |
人源 |
生長抑制素I基因的啟動子 |
gamma氨基丁酸能抑制性神經(jīng)元SST亞型特異性啟動子 |
|
TH |
2.5kb |
大鼠 |
酪氨酸羥化酶基因啟動子 |
多巴胺能神經(jīng)元特異性啟動子 |
|
GFAP |
2.0kb |
人源 |
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子 |
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子 |
|
GFAP104 |
845bp |
人源 |
EF1a和GFAP的嵌合型啟動子 |
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子 |
|
GfaABC1D(truncated GFAP) |
681bp |
人源 |
膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子 |
星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子 |
|
ALDH1L1 |
1.3kb |
人源 |
醛脫氫酶1家族成員L1啟動子 |
丘腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子 |
|
MBP |
1.3kb |
人源 |
髓磷脂堿性蛋白啟動子 |
少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子 |
|
肝臟 |
ALB |
2.4kb |
小鼠 |
白蛋白啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
TBG |
460bp |
人源 |
甲狀腺素結(jié)合球蛋白啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
|
ApoEHCR-hAAT |
1.3kb |
人源 |
載脂蛋白E的肝細(xì)胞控制區(qū)和人α1抗胰蛋白酶啟動子的嵌合啟動子 |
肝臟特異性啟動子 |
|
心臟 |
aMHC |
0.4kb |
小鼠 |
肌球蛋白重鏈α啟動子 |
心臟特異性啟動子 |
cTNT+intron |
0.7kb |
雞 |
心肌肌鈣蛋白T啟動子 |
心肌特異性啟動子 |
|
眼睛 |
Rep65 |
0.7kb |
小鼠 |
視網(wǎng)膜色素上皮65啟動子 |
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子 |
VMD2 promoter |
0.65bp |
人源 |
卵黃形成黃斑性營養(yǎng)不良2基因啟動子 |
視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子 |
|
胰腺 |
Insulin |
0.85kb |
小鼠 |
胰島素基因啟動子 |
胰腺β細(xì)胞特異性啟動子 |
PDX1 |
2.7kb |
小鼠 |
胰十二指腸同源盒1啟動子 |
胰腺β細(xì)胞特異性啟動子 |
|
血管 |
SM22a |
0.45kb |
小鼠 |
SM22α啟動子 |
血管平滑肌特異性啟動子 |
ICAM2 |
0.15kb |
人源 |
細(xì)胞間粘附分子2啟動子 |
血管內(nèi)皮特異性啟動子 |
|
CD68 |
0.7kb |
人源 |
CD68分子啟動子 |
單核巨噬細(xì)胞特異性啟動子 |
|
F4/80 |
1.2kb |
小鼠 |
F4/80基因promoter |
巨噬細(xì)胞特異性啟動子 |
|
肌肉 |
MCK |
1.3kb |
小鼠 |
肌酸激酶基因啟動子 |
肌肉細(xì)胞特異性啟動子 |
3×enhancer McK |
728bp |
小鼠 |
修改的肌酸激酶基因啟動子 |
肌肉細(xì)胞特異性啟動子 |
|
腎臟 |
NPHS1 |
1.2kb |
小鼠 |
Nephrin 1基因啟動子 |
腎臟特異性啟動子 |
7.4 你們探針AAV病毒的最小規(guī)格是多少?
我們的探針AAV病毒是按照50μl/支的規(guī)格進(jìn)行分裝的,因此出售的最小規(guī)格是50μl。
7.5 AAV血清型很多,你們有其他血清型的探針AAV病毒嗎,比如逆行AAV血清型?
對于大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)探針,我們通常將其包裝成AAV9血清型,目前還沒有嘗試逆行AAV血清型。如果您需要逆行血清型,我們也可以幫您包裝。目前我們可以為您包裝AAV1,AAV2, AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh10,AAV retro,AAV ANC80,AAV DJ & AAV DJ-8,AAV PhpB & AAV PhpeB,AAV 7m8和AAV shh10等血清型。
8.參考文獻(xiàn)
8.1 Wan, J., et al. (2021). "A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics." Nat Neurosci.
8.2 Sun, F., et al. (2020). "Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo." Nat Methods 17(11): 1156-1166.
8.3 Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.
8.4 Peng, W., et al. (2020). "Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons." Science 369(6508).
8.5 Jing, M., et al. (2019). "G-protein-coupled receptor-based sensors for imaging neurochemicals with high sensitivity and specificity." J Neurochem 151(3): 279-288.
8.6 Feng, J., et al. (2019). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Vivo Detection of Norepinephrine." Neuron 102(4): 745-761 e748.
8.7 Sun, F., et al. (2018). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice." Cell 174(2): 481-496 e419.
8.8 Jing, M., et al. (2018). "A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies." Nat Biotechnol 36(8): 726-737.