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當(dāng)前位置:首頁 > 專題 > 光遺傳 / 化學(xué)遺傳 / 生物探針

神經(jīng)遞質(zhì)探針


1.研究背景

人類大腦約有860億個神經(jīng)元,這些神經(jīng)元由數(shù)萬億個突觸連接在一起。神經(jīng)元的主要功能是接收、整合和傳遞信息。它們通過電化學(xué)信號進(jìn)行交流,并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),從而控制動物的認(rèn)知和行為。

神經(jīng)科學(xué)研究的重點,就是從細(xì)胞和分子水平了解神經(jīng)元如何相互連接和交流,這對于解析動物認(rèn)知和行為背后的神經(jīng)環(huán)路具有重大意義。興奮是神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的方式,神經(jīng)纖維受到刺激后,膜內(nèi)外電位會產(chǎn)生一系列變化而產(chǎn)生興奮,興奮產(chǎn)生后先在同一個神經(jīng)元上以動作電位的形式傳導(dǎo),興奮跨過突觸間隙時通過電化學(xué)信號的轉(zhuǎn)變,再傳遞到下一個神經(jīng)元。

突觸處有兩種類型的化學(xué)信使,神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)。神經(jīng)遞質(zhì)通過突觸間隙擴(kuò)散,特異地作用于突觸后細(xì)胞上的受體,從而完成信息傳遞功能。而神經(jīng)調(diào)質(zhì)則與突觸后細(xì)胞上的受體結(jié)合后,增強(qiáng)或削弱遞質(zhì)的效應(yīng),從而調(diào)節(jié)突觸信息傳遞。例如,谷氨酸和γ-氨基丁酸等神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合突觸后細(xì)胞上的受體后,可以迅速地使突觸后神經(jīng)元去極化或超極化,進(jìn)而直接調(diào)控這些神經(jīng)元的活動。對于神經(jīng)調(diào)質(zhì),它們大多與GPCRs結(jié)合后誘發(fā)突觸前或突觸后電位,不直接引起突觸后生物學(xué)效應(yīng),但能調(diào)節(jié)遞質(zhì)在突觸前的釋放及突觸后細(xì)胞的興奮性,調(diào)節(jié)突觸后細(xì)胞對遞質(zhì)的反應(yīng)。

操控和檢測神經(jīng)元之間的交流是神經(jīng)科學(xué)研究的主要手段,許多遺傳工具已經(jīng)被開發(fā)出來,這些遺傳工具通過腺相關(guān)病毒(AAV)等病毒載體用于神經(jīng)環(huán)路的操控和成像。目前,光遺傳學(xué)化學(xué)遺傳學(xué)工具被用來直接操控突觸前神經(jīng)元動作電位的產(chǎn)生,鈣成像用于檢測突觸后神經(jīng)元內(nèi)的信號傳遞。然而,高靈敏度、高特異性和高時空分辨率的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)檢測技術(shù)還不成熟。

傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)檢測技術(shù),主要是通過微透析對腦脊液進(jìn)行采樣并生化監(jiān)測、通過碳纖電極進(jìn)行記錄,這些檢測手段各自存在諸多弊端,例如特異性差、靈敏度低和時空分辨率差,難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實動態(tài)信息等。為了解決這一系列的問題,眾多神經(jīng)科學(xué)家一直在致力于優(yōu)化已有的方法或者開發(fā)新的技術(shù),以求彌補(bǔ)短板,取得突破。

2.開發(fā)&原理

自2018年起,北京大學(xué)李毓龍教授課題組通過偶聯(lián)GPCR和循環(huán)重排熒光蛋白cpFP開發(fā)出了很多檢測神經(jīng)遞質(zhì)的可遺傳編碼的熒光探針。神經(jīng)遞質(zhì)與GPCR的結(jié)合會引起后者構(gòu)象的改變,而這種變化又會引起cpFP發(fā)生構(gòu)象改變,進(jìn)而影響其發(fā)色團(tuán)周圍的微環(huán)境,最終導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度的改變,這種熒光變化可以通過熒光顯微鏡檢測到(Fig 1a和1b)。這些可遺傳編碼的熒光探針被命名為GRAB(GPCR Activation-Based)探針,用于以較高的時空分辨率在體檢測神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化。

Fig1a:綠色神經(jīng)遞質(zhì)探針(cpEGFP-based)的工作原理 Fig1b:紅色神經(jīng)遞質(zhì)探針(cpmApple-based)的工作原理


3.探針特征(已發(fā)表)

探針名稱

所檢測神經(jīng)
化學(xué)物質(zhì)

版本

顏色

骨架

親和力

信號響應(yīng)幅度

動力學(xué)

下游
信號偶聯(lián)

參考
文獻(xiàn)

Ach2.0

乙酰膽堿

第一代

綠色

人M3受體

EC50~1uM

ΔF/F0~90%

τon~200ms,
τoff~800ms

弱偶聯(lián)

[8]

Ach3.0

乙酰膽堿

第二代

綠色

人M3受體

EC50~2uM

ΔF/F0~280%

τon~112ms,
τoff~580ms

幾乎不偶聯(lián)

[3]

Ach3.0-mut

乙酰膽堿

第二代對照

綠色

人M3受體

EC50~0uM

(W200A突變)

ΔF/F0~1.8%

-

-

[3]

DA1m

多巴胺

第一代

綠色

人D2受體

EC50~130nM
中等親和力

ΔF/F0~90%

τon~60ms,
τoff~700ms

幾乎不偶聯(lián)

[7]

DA1h

多巴胺

第一代

綠色

人D2受體

EC50~10nM
高親和力

ΔF/F0~90%

τon~140ms,
τoff~2500ms

幾乎不偶聯(lián)

[7]

DAmut(1st)

多巴胺

第一代對照

綠色

人D2受體

EC50~0uM

C118A和S193N突變

無效應(yīng)

-

-

[7]

DA2m(DA4.4)

多巴胺

第二代

綠色

人D2受體

EC50~90nM
中等親和力

ΔF/F0~340%

τon~40ms,
τoff~1300ms

非常小的偶聯(lián)

[2]

DA2h(DA4.3)

多巴胺

第二代

綠色

人D2受體

EC50~7nM
高親和力

ΔF/F0~280%

τon~50ms,
τoff~7300ms

非常小的偶聯(lián)

[2]

DAmut(2nd)

多巴胺

第二代對照

綠色

人D2受體

EC50~0uM

C1183.36A和S1935.42N突變

無效應(yīng)

-

-

[2]

rDA1m (rDA2.5m)

多巴胺

-

紅色

人D2受體

EC50~95nM
中等親和力

ΔF/F0~150%

τon~80ms,
τoff~770ms

非常小的偶聯(lián)

[2]

rDA1h (rDA2.5h)

多巴胺

-

紅色

人D2受體

EC50~4nM
中等親和力

ΔF/F0~100%

τon~60ms,
τoff~2150ms

非常小的偶聯(lián)

[2]

rDAmut (rDA2.5mut)

多巴胺

對照

紅色

人D2受體

EC50~0uM

C1183.36A和S1935.42N突變

無效應(yīng)

-

-

[2]

NE1m(NE2.1)

去甲腎上腺素

-

綠色

人a2A受體

EC50~930nM
中等親和力

ΔF/F0~230%

τon ~70ms,
τoff~ 750ms

不偶聯(lián)

[6]

NE1h(NE2.2)

去甲腎上腺素

-

綠色

人a2A受體

EC50~83nM
高親和力

ΔF/F0~130%

τon ~30ms,
τoff~ 2000ms

不偶聯(lián)

[6]

NEmut

去甲腎上腺素

對照

綠色

人a2A受體

EC50~0uM

S5.46A突變

無效應(yīng)

-

-

[6]

Ado1.0

腺苷

-

綠色

人A2A受體

EC50~60nM

ΔF/F0~130%

τon~36ms,
τoff~1890ms

幾乎不偶聯(lián)

[4]

Ado1.0mut

腺苷

對照

綠色

人A2A受體

EC50~0uM

F168A突變

無效應(yīng)

-

-

[4]

5-HT1.0

五羥色胺

-

綠色

人5-HT2C
受體

EC50~22nM

ΔF/F0~250%

τon~0.2s,
τoff~3.1s

不偶聯(lián)

[1]

5-HTmut

五羥色胺

對照

綠色

人5-HT2C
受體

EC50~0uM

D1343.32Q突變

無效應(yīng)

-

-

[1]



4.探針資源

在李教授組的授權(quán)下,山東維真生物可以出售這些探針的病毒產(chǎn)品(AAV產(chǎn)品為主),以幫助神經(jīng)科學(xué)工作者在體內(nèi)檢測乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、腺苷(Ado)、腺苷三磷酸(ATP)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、神經(jīng)肽Y(NPY)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、精氨酸血管加壓素(AVP)、催產(chǎn)素(OXT)、生長激素抑制素(SST)、神經(jīng)降壓肽(NTS)、內(nèi)源性大麻素(eCB)、大麻素(AEA)和褪黑素(MT)等各種遞質(zhì)的動態(tài)變化,歡迎大家點擊“AAV工具” 中的“神經(jīng)遞質(zhì)探針”進(jìn)行選購!?。?



5.探針載體獲取

以上所述所有GRAB探針均由北京大學(xué)李毓龍組研發(fā)或聯(lián)合開發(fā)。部分探針已經(jīng)發(fā)表,部分探針尚未發(fā)表。李毓龍組不僅開發(fā)了這些探針,還開發(fā)了這些探針的Cre依賴和突變版本,包括紅色和綠色的熒光信號,以滿足神經(jīng)科學(xué)工作者多樣化的實驗需求。此外,為了提升探針的性能,這些探針還在持續(xù)優(yōu)化中,不斷更新迭代。

以上探針均由維真生物協(xié)助提供。其中已發(fā)表的探針(產(chǎn)品編號中含PUB的病毒為文章中所用病毒),維真生物均有現(xiàn)貨,當(dāng)天上午下單,下午/次日即可發(fā)貨;若由于產(chǎn)品脫銷無庫存,1-2周即可完成入庫并發(fā)貨;您可以通過公司技術(shù)熱線400-077-2566訂購。

如若您對未發(fā)表的探針或者探針序列感興趣,您也可通過上述方式與我們聯(lián)系,,我們將在第一時間幫您與李教授組溝通,征得李教授組的同意之后,我們也可以出售給您。


6.探針病毒使用

由于血腦屏障的存在,普通的注射方式很難實現(xiàn)病毒在腦區(qū)較高且特異性的表達(dá),因此研究者通常需要借助腦立體定位儀將探針病毒注射至特定腦區(qū)(詳見Fig 2),以感染全腦和局部腦區(qū)。

Fig2:腦立體定位注射的示意圖
(Van der Perren, A., et al, V. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016)



腦立體定位注射的詳細(xì)步驟如下:

1. 實驗動物稱重,進(jìn)行麻醉;

2. 待實驗動物完全麻醉后,用剃毛器將動物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發(fā)剃除干凈;

3. 將麻醉后的實驗動物固定于腦立體定位儀上,具體操作為:實驗動物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護(hù)其雙眼;將門齒掛在門齒掛鉤上,確保頭部保持固定;檢查左右耳桿是否在同一水平上,將左右耳桿通過外耳道插入實驗動物耳內(nèi)。實驗動物固定好的標(biāo)準(zhǔn)為:鼻對正中,頭部不動,提尾不掉,目測大腦放置水平;

4. 手術(shù):用碘伏對實驗動物頭皮進(jìn)行消毒清理,用手術(shù)刀沿中間位置剪開頭皮,用鑷子對表面的結(jié)締組織進(jìn)行清理,暴露實驗動物的顱骨表面;然后進(jìn)行調(diào)平,首先找到前囟這個坐標(biāo),并將其歸零,然后向左右調(diào)平,使左右兩側(cè)處于同一水平,調(diào)整前后囟,使前后囟也在同一水平。

5.病毒注射:通過查詢實驗動物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區(qū)的位置(Fig 3a和3b是大鼠和小鼠的腦譜),并確定其坐標(biāo)值,即ML值(X軸)、AP值(Y軸)、DV值(Z軸);根據(jù)目標(biāo)腦區(qū)設(shè)定好坐標(biāo),移開注射針,用顱骨鉆開窗(由于顱骨薄,故務(wù)必注意顱骨鉆的力度?。。僮鲿r避免傷及腦組織;微量注射器吸取病毒液,隨后固定在定位儀上,根據(jù)設(shè)好的坐標(biāo)進(jìn)行病毒注射,注射速度控制在0.1-0.15μl/min,注射劑量視具體實驗而定。注射完畢,留針10min,以便病毒液充分吸收,然后慢慢回針。

Fig3a:The Rat Brain Fig3b:The Mice Brain


6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動物蘇醒后, 正常喂養(yǎng), 病毒注射后2-4周可檢測轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。



7.常見問題解答

7.1 使用探針AAV病毒注射時,我該使用多大的病毒量?
考慮到病毒批次間的差異,我們建議您直接注射未稀釋的病毒原液200-400nl/site。

7.2 神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中是否能像在小鼠中一樣表達(dá)得很好?
神經(jīng)遞質(zhì)探針在大鼠中也可以很好地工作。根據(jù)李教授組已發(fā)表的論文,這些探針可以用在多種有機(jī)體中,包括果蠅、斑馬魚、老鼠和斑馬雀等。

7.3 你們是否也有廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的探針AAV病毒?
有些探針在開發(fā)時已構(gòu)建了廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的載體,如CAG,EFs,EF1α,CamKIIα,GfaABC1D和TRE等,具體可以參考探針資源部分的表2。當(dāng)然,如果您對其他組織特異性啟動子感興趣,請參考我們的組織特異性啟動子列表(見下表)來選擇您感興趣的啟動子。如果您找不到想用的啟動子,可以聯(lián)系我們。

組織

啟動子名稱

啟動子
大小

啟動子
來源

啟動子描述

啟動子應(yīng)用

神經(jīng)

hSyn

471bp

人源

突觸蛋白1啟動子

神經(jīng)元特異性啟動子

CamKIIa

1.2kb

小鼠

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II α啟動子

大腦新皮質(zhì)和海馬興奮性神經(jīng)元特異性啟動子

c-fos

1.7kb

小鼠

c-fos基因啟動子

興奮性神經(jīng)元啟動子

Mecp2

230bp

小鼠

甲基 CpG 結(jié)合蛋白 2啟動子

短的神經(jīng)元特異性啟動子

NSE

1.3kb

小鼠

烯醇化酶啟動子

神經(jīng)元特異性啟動子

Somatostat(SST)

1.2kb

人源

生長抑制素I基因的啟動子

gamma氨基丁酸能抑制性神經(jīng)元SST亞型特異性啟動子

TH

2.5kb

大鼠

酪氨酸羥化酶基因啟動子

多巴胺能神經(jīng)元特異性啟動子

GFAP

2.0kb

人源

膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子

星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子

GFAP104

845bp

人源

EF1a和GFAP的嵌合型啟動子

星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子

GfaABC1D(truncated GFAP)

681bp

人源

膠質(zhì)纖維酸性蛋白啟動子

星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子

ALDH1L1

1.3kb

人源

醛脫氫酶1家族成員L1啟動子

丘腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子

MBP

1.3kb

人源

髓磷脂堿性蛋白啟動子

少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子

肝臟

ALB

2.4kb

小鼠

白蛋白啟動子

肝臟特異性啟動子

TBG

460bp

人源

甲狀腺素結(jié)合球蛋白啟動子

肝臟特異性啟動子

ApoEHCR-hAAT

1.3kb

人源

載脂蛋白E的肝細(xì)胞控制區(qū)和人α1抗胰蛋白酶啟動子的嵌合啟動子

肝臟特異性啟動子

心臟

aMHC

0.4kb

小鼠

肌球蛋白重鏈α啟動子

心臟特異性啟動子

cTNT+intron

0.7kb

心肌肌鈣蛋白T啟動子

心肌特異性啟動子

眼睛

Rep65

0.7kb

小鼠

視網(wǎng)膜色素上皮65啟動子

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子

VMD2 promoter

0.65bp

人源

卵黃形成黃斑性營養(yǎng)不良2基因啟動子

視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性啟動子

胰腺

Insulin

0.85kb

小鼠

胰島素基因啟動子

胰腺β細(xì)胞特異性啟動子

PDX1

2.7kb

小鼠

胰十二指腸同源盒1啟動子

胰腺β細(xì)胞特異性啟動子

血管

SM22a

0.45kb

小鼠

SM22α啟動子

血管平滑肌特異性啟動子

ICAM2

0.15kb

人源

細(xì)胞間粘附分子2啟動子

血管內(nèi)皮特異性啟動子

CD68

0.7kb

人源

CD68分子啟動子

單核巨噬細(xì)胞特異性啟動子

F4/80

1.2kb

小鼠

F4/80基因promoter

巨噬細(xì)胞特異性啟動子

肌肉

MCK

1.3kb

小鼠

肌酸激酶基因啟動子

肌肉細(xì)胞特異性啟動子

3×enhancer McK

728bp

小鼠

修改的肌酸激酶基因啟動子

肌肉細(xì)胞特異性啟動子

腎臟

NPHS1

1.2kb

小鼠

Nephrin 1基因啟動子

腎臟特異性啟動子


7.4 你們探針AAV病毒的最小規(guī)格是多少?
我們的探針AAV病毒是按照50μl/支的規(guī)格進(jìn)行分裝的,因此出售的最小規(guī)格是50μl。

7.5 AAV血清型很多,你們有其他血清型的探針AAV病毒嗎,比如逆行AAV血清型?
對于大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)探針,我們通常將其包裝成AAV9血清型,目前還沒有嘗試逆行AAV血清型。如果您需要逆行血清型,我們也可以幫您包裝。目前我們可以為您包裝AAV1,AAV2, AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAVrh10,AAV retro,AAV ANC80,AAV DJ & AAV DJ-8,AAV PhpB & AAV PhpeB,AAV 7m8和AAV shh10等血清型。



8.參考文獻(xiàn)

8.1 Wan, J., et al. (2021). "A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics." Nat Neurosci.

8.2 Sun, F., et al. (2020). "Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo." Nat Methods 17(11): 1156-1166.

8.3 Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.

8.4 Peng, W., et al. (2020). "Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons." Science 369(6508).

8.5 Jing, M., et al. (2019). "G-protein-coupled receptor-based sensors for imaging neurochemicals with high sensitivity and specificity." J Neurochem 151(3): 279-288.

8.6 Feng, J., et al. (2019). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Vivo Detection of Norepinephrine." Neuron 102(4): 745-761 e748.

8.7 Sun, F., et al. (2018). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice." Cell 174(2): 481-496 e419.

8.8 Jing, M., et al. (2018). "A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies." Nat Biotechnol 36(8): 726-737.


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