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質 粒 抽 提
質粒提取目的
質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或者表達的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，要想從細菌中獲得質粒DNA,需要通過質粒提取的方法。
質粒提取的幾種方法及原理
質粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細菌懸浮于含Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。
煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細菌染色體DNA比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網狀結構，通過高速離心可以分離得到質粒DNA 。
質粒提取方法選擇
質粒提取的方法主要根據(jù)質粒DNA分子量的大小，所用細菌的種屬，細菌裂解釋放DNA后的純化方法和實驗要求來選擇。
1、質粒DNA的分子大于15kb時，在質粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破壞細胞壁和細胞膜，這樣可以緩解高滲透壓的細菌在釋放質粒DNA時的壓力，保護質粒DNA。
2、小分子的質粒DNA可以選用相對劇烈的方法來分離DNA?？梢杂弥蠓蟹ǎ瑝A裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢劑裂解細菌。這些方法會使DNA變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起，在恢復正常條件后，DNA便會復性。
3、對于那些經變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用煮沸法。而這些碳水化合物在密度梯度中會緊靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的區(qū)帶，因此很難避免，而這些碳水化合物可抑制多種限制酶的活性。這類菌株制備質粒時，不宜采用煮沸法。
4、菌株含有限制性核酸內切酶A的不宜使用煮沸法。因為煮沸不能使內切酶A完全失活，在后續(xù)實驗中再用限制性內切酶消化時，質粒DNA會被降解。此時必須用酚：氯仿進行抽提。
煮沸法時間短，（特點） 操作簡單，時間短；（缺點）條件過于劇烈，易造成質粒斷裂，回收率較低。
堿裂解法操作簡單，（特點） 所得質粒量較多且污染少，（缺點）花費的時間較長。
質粒提取試劑盒選擇
1、小提質粒：（特點）簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數(shù)細胞轉染實驗
2、中提質粒：（特點）質粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數(shù)細胞轉染實驗
3、大提質粒：（特點）質粒DNA量非常高，雜質少，無內毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關病毒包裝，多數(shù)細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗
大多數(shù)試劑盒都是在堿裂解法的基礎上優(yōu)化改進的。
常用的質粒提取試劑盒有：OMEGA，BIOMIGA，Sigma，TaKaRa,promega,天根，康為世紀，生工等。
質粒抽提按得到質粒DNA的量可分為小提，中提，大提。
質粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的質粒DNA量較少，其特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，此質粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應，PCR以及部分細胞系的轉染等對質粒濃度要求不高的實驗。維真生物采用高通量小提試劑盒，從1ml菌液中提取質粒，用90ul洗脫液洗脫得到的質粒濃度為100-200ng/ul，可以滿足大部分實驗要求，也可以直接用于一般的腺病毒包裝，不過維真生物慢病毒、腺相關病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質量。
質粒中提得到的質粒DNA的量介于小提跟大提之間，一般用30-50ml菌液提取，提取的質?？捎糜诎盖?、PCR、測序、連接、轉化、文庫篩選、體外翻譯、轉染一些常規(guī)的傳代細胞等。從50ml菌液中提取質?？傻降?00ul質粒濃度為0.7-1ug/ul的質粒。
質粒大提是質粒大量提取的簡稱，有些實驗室稱之為大抽。質粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大規(guī)模地從細菌中將擴增的質粒提取出來。一般的大提質粒試劑盒都是使用純化柱，提取出來的質粒純度高，雜質少，無內毒素，一般用于細胞的轉染等對質粒純度高的實驗。從200ml菌液中提取質粒，1000ul洗脫液洗脫后得到的質粒濃度為0.5-2ug/ul。 維真生物慢病毒、腺相關病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質量。
注：在一個細菌細胞中只有5個以下的相同質粒時，該質粒是低拷貝質粒；當在一個細菌細胞中可以有幾百個相同質粒時則該質粒是高拷貝質粒。低拷貝質粒在等量的菌體中的數(shù)量遠低于高拷貝質粒，因此用等量菌體提取質粒時，提取的低拷貝質粒的濃度會很低。維真生物的過表達載體是低拷貝質粒，對于此類質粒載體，若需要大量質?；蛘咝√豳|粒的實驗效果不好時，則需要加大提取的菌體量，可進行質粒中提或者大提，另外，使用去內毒素的試劑盒抽提質粒時，也會降低最終得到質粒的濃度
質粒提取常見問題及解決方案
質粒提取的常見問題
1、菌液較多：可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解，導致導致提取量和純度偏低。
質粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會細菌細胞壁和細胞膜，使菌體中的質粒DNA釋放出來，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復中性環(huán)境，利于質粒DNA復性，溶液II中SDS的Na+會被K+置換，SDS變?yōu)镻DS并結合大分子的基因組DNA,蛋白質和細胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免使基因組DNA斷裂污染質粒。所用時間不應超過5min，以免質粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進行后續(xù)操作會得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。
2、菌液培養(yǎng)時間：使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時間一般在17小時左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時間短會導致菌體生長不充分，培養(yǎng)時間過長菌體會出現(xiàn)死亡，都會影響收集的菌體量，從而影響抽提出的質粒DNA的量。在接菌前，可以將保存的菌種先進行活化，然后再接菌，可使過夜培養(yǎng)的菌液生長更充分，在一定范圍內菌體量的增加，可以提高所提質粒的濃度。
3、宿主菌株：宿主菌株的種類將會影響質粒的收獲量。含內源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們的衍生菌株，通常因為內源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到的質粒容易降解，推薦將質粒轉化至不含內源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進行質粒純化。
4、質?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。
5、菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現(xiàn)質粒丟失的情況，導致無法提出質粒，若有保存的質粒可以轉化后再挑取單克隆搖菌提質粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數(shù)質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。
7、溶液使用不當：溶液II在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。
8、吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。
9、質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
10、乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺上風吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。
12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
13、洗脫體積太?。?/strong>洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
14、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果。
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