質(zhì) 粒 抽 提
質(zhì)粒提取目的
質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或者表達(dá)的重要媒介，這種基因運(yùn)載工具在基因工程中具有極廣泛的應(yīng)用價(jià)值，要想從細(xì)菌中獲得質(zhì)粒DNA,需要通過質(zhì)粒提取的方法。
質(zhì)粒提取的幾種方法及原理
質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)差異來(lái)分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來(lái)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來(lái)，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對(duì)，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會(huì)分離，這是因?yàn)樗麄兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法對(duì)于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對(duì)大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性，機(jī)械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細(xì)菌染色體DNA復(fù)性較慢，會(huì)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
質(zhì)粒提取方法選擇
質(zhì)粒提取的方法主要根據(jù)質(zhì)粒DNA分子量的大小，所用細(xì)菌的種屬，細(xì)菌裂解釋放DNA后的純化方法和實(shí)驗(yàn)要求來(lái)選擇。
1、質(zhì)粒DNA的分子大于15kb時(shí)，在質(zhì)粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細(xì)菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，這樣可以緩解高滲透壓的細(xì)菌在釋放質(zhì)粒DNA時(shí)的壓力，保護(hù)質(zhì)粒DNA。
2、小分子的質(zhì)粒DNA可以選用相對(duì)劇烈的方法來(lái)分離DNA?？梢杂弥蠓蟹?，堿裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢劑裂解細(xì)菌。這些方法會(huì)使DNA變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起，在恢復(fù)正常條件后，DNA便會(huì)復(fù)性。
3、對(duì)于那些經(jīng)變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用煮沸法。而這些碳水化合物在密度梯度中會(huì)緊靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的區(qū)帶，因此很難避免，而這些碳水化合物可抑制多種限制酶的活性。這類菌株制備質(zhì)粒時(shí)，不宜采用煮沸法。
4、菌株含有限制性核酸內(nèi)切酶A的不宜使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒苁箖?nèi)切酶A完全失活，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中再用限制性內(nèi)切酶消化時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。此時(shí)必須用酚：氯仿進(jìn)行抽提。
煮沸法時(shí)間短，（特點(diǎn)） 操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短；（缺點(diǎn)）條件過于劇烈，易造成質(zhì)粒斷裂，回收率較低。
堿裂解法操作簡(jiǎn)單，（特點(diǎn)） 所得質(zhì)粒量較多且污染少，（缺點(diǎn)）花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。
質(zhì)粒提取試劑盒選擇
1、小提質(zhì)粒：（特點(diǎn)）簡(jiǎn)單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測(cè)序，PCR，腺病毒包裝、多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
2、中提質(zhì)粒：（特點(diǎn)）質(zhì)粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測(cè)序，多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
3、大提質(zhì)粒：（特點(diǎn)）質(zhì)粒DNA量非常高，雜質(zhì)少，無(wú)內(nèi)毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關(guān)病毒包裝，多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染或其他需要大量質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)
大多數(shù)試劑盒都是在堿裂解法的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進(jìn)的。
常用的質(zhì)粒提取試劑盒有：OMEGA，BIOMIGA，Sigma，TaKaRa,promega,天根，康為世紀(jì)，生工等。
質(zhì)粒抽提按得到質(zhì)粒DNA的量可分為小提，中提，大提。
質(zhì)粒小提用的菌液量很少，一般1-5ml，提出的質(zhì)粒DNA量較少，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，能同時(shí)處理大量試樣，所得DNA有一定純度，此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應(yīng)，PCR以及部分細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染等對(duì)質(zhì)粒濃度要求不高的實(shí)驗(yàn)。維真生物采用高通量小提試劑盒，從1ml菌液中提取質(zhì)粒，用90ul洗脫液洗脫得到的質(zhì)粒濃度為100-200ng/ul，可以滿足大部分實(shí)驗(yàn)要求，也可以直接用于一般的腺病毒包裝，不過維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進(jìn)行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。
質(zhì)粒中提得到的質(zhì)粒DNA的量介于小提跟大提之間，一般用30-50ml菌液提取，提取的質(zhì)?？捎糜诎盖小CR、測(cè)序、連接、轉(zhuǎn)化、文庫(kù)篩選、體外翻譯、轉(zhuǎn)染一些常規(guī)的傳代細(xì)胞等。從50ml菌液中提取質(zhì)?？傻降?00ul質(zhì)粒濃度為0.7-1ug/ul的質(zhì)粒。
質(zhì)粒大提是質(zhì)粒大量提取的簡(jiǎn)稱，有些實(shí)驗(yàn)室稱之為大抽。質(zhì)粒大提用于大量菌液的提取，100ml-500ml 均可，大規(guī)模地從細(xì)菌中將擴(kuò)增的質(zhì)粒提取出來(lái)。一般的大提質(zhì)粒試劑盒都是使用純化柱，提取出來(lái)的質(zhì)粒純度高，雜質(zhì)少，無(wú)內(nèi)毒素，一般用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)染等對(duì)質(zhì)粒純度高的實(shí)驗(yàn)。從200ml菌液中提取質(zhì)粒，1000ul洗脫液洗脫后得到的質(zhì)粒濃度為0.5-2ug/ul。 維真生物慢病毒、腺相關(guān)病毒（AAV）包裝一般使用大提試劑盒進(jìn)行抽提，以保證高滴度及穩(wěn)定的質(zhì)量。
注：在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中只有5個(gè)以下的相同質(zhì)粒時(shí)，該質(zhì)粒是低拷貝質(zhì)粒；當(dāng)在一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中可以有幾百個(gè)相同質(zhì)粒時(shí)則該質(zhì)粒是高拷貝質(zhì)粒。低拷貝質(zhì)粒在等量的菌體中的數(shù)量遠(yuǎn)低于高拷貝質(zhì)粒，因此用等量菌體提取質(zhì)粒時(shí)，提取的低拷貝質(zhì)粒的濃度會(huì)很低。維真生物的過表達(dá)載體是低拷貝質(zhì)粒，對(duì)于此類質(zhì)粒載體，若需要大量質(zhì)粒或者小提質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)效果不好時(shí)，則需要加大提取的菌體量，可進(jìn)行質(zhì)粒中提或者大提，另外，使用去內(nèi)毒素的試劑盒抽提質(zhì)粒時(shí)，也會(huì)降低最終得到質(zhì)粒的濃度
質(zhì)粒提取常見問題及解決方案
質(zhì)粒提取的常見問題
1、菌液較多：可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會(huì)降低質(zhì)粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會(huì)影響裂解，導(dǎo)致導(dǎo)致提取量和純度偏低。
質(zhì)粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會(huì)細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體中的質(zhì)粒DNA釋放出來(lái)，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復(fù)中性環(huán)境，利于質(zhì)粒DNA復(fù)性，溶液II中SDS的Na+會(huì)被K+置換，SDS變?yōu)镻DS并結(jié)合大分子的基因組DNA,蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質(zhì)粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免使基因組DNA斷裂污染質(zhì)粒。所用時(shí)間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)操作會(huì)得到鼻涕狀的沉淀，無(wú)法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當(dāng)按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。
2、菌液培養(yǎng)時(shí)間：使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時(shí)間一般在17小時(shí)左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時(shí)間短會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)不充分，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)菌體會(huì)出現(xiàn)死亡，都會(huì)影響收集的菌體量，從而影響抽提出的質(zhì)粒DNA的量。在接菌前，可以將保存的菌種先進(jìn)行活化，然后再接菌，可使過夜培養(yǎng)的菌液生長(zhǎng)更充分，在一定范圍內(nèi)菌體量的增加，可以提高所提質(zhì)粒的濃度。
3、宿主菌株：宿主菌株的種類將會(huì)影響質(zhì)粒的收獲量。含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們的衍生菌株，通常因?yàn)閮?nèi)源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來(lái)的核酸酶的作用下，將會(huì)顯著影響最終收獲量，或者純化到的質(zhì)粒容易降解，推薦將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含內(nèi)源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a進(jìn)行質(zhì)粒純化。
4、質(zhì)?？截悢?shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時(shí)的體積。
5、菌體中無(wú)質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。例如，柯斯質(zhì)粒在大腸桿菌中長(zhǎng)期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)接種單菌落。有時(shí)菌種保存一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒丟失的情況，導(dǎo)致無(wú)法提出質(zhì)粒，若有保存的質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化后再挑取單克隆搖菌提質(zhì)粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會(huì)導(dǎo)致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對(duì)低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時(shí)可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
7、溶液使用不當(dāng)：溶液II在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。
8、吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請(qǐng)分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質(zhì)粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長(zhǎng)率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。
9、質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時(shí)) ：洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長(zhǎng)溶解時(shí)間。
10、乙醇?xì)埩簦?/strong>漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺(tái)上風(fēng)吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準(zhǔn)確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來(lái)的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。
12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
13、洗脫體積太?。?/strong>洗脫體積對(duì)回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
14、洗脫時(shí)間過短：洗脫時(shí)間對(duì)回收率也會(huì)有一定影響。洗脫時(shí)在說明書的建議時(shí)間基礎(chǔ)上適當(dāng)延長(zhǎng)靜置或者洗脫兩次可達(dá)到較好的效果。
