蛋白磷酸化攻略大全
前幾日，我們?yōu)榇蠹医榻B了關(guān)于反相蛋白微陣列RPPA的有關(guān)知識（『江湖召集令』癌癥相關(guān)蛋白及磷酸化水平大數(shù)據(jù)等你來分析?。肦PPA技術(shù)可以同時分析成百上千種細(xì)胞或者組織樣本中不同蛋白的表達(dá)情況，包含修飾后蛋白（如磷酸化、甲基化、乙?；┑牟町惐磉_(dá)比對分析，那么，關(guān)于蛋白質(zhì)翻譯后修飾你了解多少呢，蛋白質(zhì)磷酸化究竟又是怎么一回事？今天，小V就和大家一起來探索有關(guān)蛋白質(zhì)磷酸化的那些事兒！
蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)在生命體中具有十分重要的作用，它使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，功能更完善，調(diào)節(jié)更精細(xì)，作用更專一。蛋白翻譯后修飾包括：磷酸化、糖基化、甲基化、羥基化、脂?；Ⅳ然裙矁r修飾。其中，蛋白磷酸化是非常常見和非常重要的翻譯后修飾之一，它在每個生物的各個方面都扮演著重要的角色，例如基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、細(xì)胞增殖、分化、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)控、腫瘤發(fā)生等。
一．蛋白磷酸化簡介
蛋白磷酸化是在酶的催化作用下，將ATP γ位的磷酸基團(tuán)，轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈上的過程。該過程是可逆的，催化蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化的酶被稱為蛋白激酶（protein kinase, PK），而催化蛋白質(zhì)去磷酸化的酶被稱為蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）（圖1）。蛋白磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活性和功能的重要機(jī)制。
圖1：蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化的過程（圖片來源于網(wǎng)絡(luò)）
二．蛋白磷酸化分類及位點(diǎn)
蛋白磷酸化是生物體內(nèi)普遍存在的一種調(diào)節(jié)方式。據(jù)報(bào)道，人類基因組編碼的21000個蛋白質(zhì)中，90%以上發(fā)生了磷酸化。根據(jù)被磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白質(zhì)磷酸化可分為 4 大類，具體分類和磷酸化位點(diǎn)見表1，磷酸化的9個氨基酸分子式見圖2。超過三分之一的蛋白磷酸化發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上：其中絲氨酸殘基最多（86.4%），其次是蘇氨酸殘基（11.8%），酪氨酸殘基最少（1.8%）。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化組成了O-磷酸化。O-磷酸化在酸性條件下非常穩(wěn)定，因此在細(xì)胞生物學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中研究廣泛。而N-磷酸化由于不穩(wěn)定導(dǎo)致其檢測極具挑戰(zhàn)性。加之，催化N-磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的缺乏進(jìn)一步限制了它的研究。其他兩類磷酸化（S-磷酸化和酰基磷酸化）的研究報(bào)道卻少之又少。
表1：蛋白磷酸化類型及位點(diǎn)
圖2：磷酸化的9個氨基酸分子式
（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）
三．蛋白磷酸化相關(guān)酶
人類基因組中約有500多種激酶和200多種磷酸酶能調(diào)控蛋白的磷酸化過程，這使得蛋白磷酸化更為復(fù)雜，這些磷酸化相關(guān)酶在精細(xì)調(diào)控生物體的眾多細(xì)胞過程中可發(fā)揮關(guān)鍵作用。
1、蛋白激酶
蛋白激酶屬于激酶大家族，是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將ATP γ位的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至底物蛋白質(zhì)的特定氨基酸，從而使蛋白質(zhì)磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮生理生化功能。在人類基因組中，大約2%的人源基因編碼518個蛋白激酶。根據(jù)其磷酸化的氨基酸殘基不同，蛋白激酶可以分為五大類：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、組氨酸/賴氨酸/精氨酸蛋白激酶、半胱氨酸蛋白激酶和天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶。
2、蛋白磷酸酶
蛋白磷酸酶的功能跟蛋白激酶的功能相反，負(fù)責(zé)磷酸化蛋白的去磷酸化。目前，大約有226種已知的蛋白磷酸酶。蛋白磷酸酶分為3個家族：磷酸蛋白磷酸酶家族、金屬依賴性蛋白磷酸酶家族和蛋白酪氨酸磷酸酶家族。
四．蛋白磷酸化的檢測方法
蛋白質(zhì)磷酸化的分析和磷酸化位點(diǎn)的鑒定已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)注點(diǎn)之一。目前蛋白質(zhì)磷酸化的檢測方法主要有特異性抗體（如western blot）、p32放射性標(biāo)記、質(zhì)譜、化學(xué)生物相結(jié)合、核磁共振等。每種方法有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)（表2），研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)挑選合適的檢測方法。
表2：蛋白質(zhì)磷酸化檢測方法的比較
（B. Huang et al. International Journal of Biological Macromolecules 145 .2020）
五．定點(diǎn)突變在蛋白磷酸化研究中的作用
定點(diǎn)突變可以隨心所欲地改變已知DNA序列中的堿基。在基礎(chǔ)研究中，科研工作者通常需要通過改變DNA序列獲得突變基因，以研究基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系；或者通過改變氨基酸序列獲得突變蛋白，以研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，從微觀水平闡明生理狀態(tài)下基因的調(diào)控機(jī)理、疾病的病因和發(fā)病機(jī)制。在磷酸化蛋白的研究中，構(gòu)建模擬磷酸化和非磷酸化的突變實(shí)驗(yàn)是研究磷酸化功能效應(yīng)的一種常用方法。
1. 磷酸化位點(diǎn)的查找
磷酸化定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)的第一步首先要查找磷酸化位點(diǎn)。我們以常用的蛋白數(shù)據(jù)庫UniProt為例說明，具體步驟如下：
（1）通過https://www.uniprot.org/鏈接進(jìn)入U(xiǎn)niProt官網(wǎng)，進(jìn)入如下主界面：
（2）以人源p53蛋白為例，在Search欄（見上圖紅色標(biāo)記位置）中輸入p53，進(jìn)入如下界面：
（3）點(diǎn)擊人源p53蛋白在數(shù)據(jù)庫中的編號“Q04637”（上圖紅色箭頭所示），查看專家注釋。這里重點(diǎn)介紹“PTM/Processing”。點(diǎn)擊下圖左邊紅色箭頭指向的“PTM/Processing”欄查看分子加工、氨基酸修飾、翻譯后修飾、蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫、翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫和參考文獻(xiàn)。
（4）假如我們對15位的磷酸化位點(diǎn)修飾，點(diǎn)擊紅色圈中的15即可查看對應(yīng)的氨基酸序列（見下圖，黃色標(biāo)記的“S”）。
（5）接下來，我們返回上一頁面，點(diǎn)擊數(shù)據(jù)庫中的“Names & Taxonomy”選項(xiàng)查找該基因的mRNA序列，點(diǎn)擊藍(lán)色標(biāo)記的基因名即可查閱該基因的詳細(xì)信息。
（6）p53的mRNA序列查找可點(diǎn)擊黃色箭頭處獲?。?/span>
2. 表征磷酸化修飾的定點(diǎn)突變
1）表征磷酸化修飾的突變氨基酸
通過第2部分磷酸化類型的介紹，我們知道Ser、Thr和Tyr殘基上的磷酸化較常見，特別是Ser。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，表征這3種磷酸化修飾的定點(diǎn)突變見表3：
表3：表征Ser、Thr和Tyr磷酸化修飾的突變氨基酸
2）表征磷酸化修飾的原理
蛋白質(zhì)的磷酸化導(dǎo)致磷酸基團(tuán)受體氨基酸殘基上增加了凈負(fù)電荷（pSer，pThr和pTyr帶2個負(fù)電荷【見上述圖2】）。而取代的酸性氨基酸（Glu和Asp）的負(fù)電荷側(cè)鏈在一定程度上模擬了蛋白質(zhì)中磷酸基團(tuán)的添加，且長度相似。為了使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確，除了構(gòu)建模擬磷酸化的突變體外，模擬非磷酸化的點(diǎn)突變構(gòu)建也是必需的，即磷酸基團(tuán)受體氨基酸殘基被一個不帶電的和不能磷酸化的氨基酸殘基所取代。目前，Ala和Phe已成功模擬非磷酸化。
3）如何選擇表征磷酸化修飾的突變氨基酸？
表征磷酸化修飾的突變氨基酸選擇主要從氨基酸的長度、大小、電荷和結(jié)構(gòu)方面選擇。例如，與磷酸化的氨基酸殘基相比，Glu或Asp除了帶1個負(fù)電荷外，還可能占據(jù)更小或不同的空間。因此，在許多情況下，Glu可能比更小的Ala能更好地模擬pSer。但是，注意不是所有情況，這2種氨基酸均已成功模擬pSer。再比如，對于非磷酸化的模擬，Ala經(jīng)常被作為取代的氨基酸殘基。但是，對于非磷酸化的Tyr，Phe可能是一個更好的的選擇。
六．應(yīng)用實(shí)例
實(shí)例一 蛋白磷酸化與肝自噬
2018年10月，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉教授課題組在Molecular Cell(IF=15.584)雜志發(fā)表了題為“mTORC1-Regulated and HUWE1-Mediated WIPI2 Degradation Controls Autophagy Flux”研究論文，該論文從采用質(zhì)譜確定WIPI2新的互作蛋白出發(fā)，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTORC1 & WIPI2 &HUWE1三者之間的調(diào)控關(guān)系、功能效應(yīng)、生物效應(yīng)和生理功能：WIPI2是mTORC1新的磷酸化底物。mTORC1通過磷酸化WIPI2，促進(jìn)WIPI2與其E3泛素連接酶HUWE1的相互作用，導(dǎo)致WIPI2的泛素化和經(jīng)蛋白酶體的降解，最終抑制自噬，調(diào)控模型示意圖見圖3。
圖3：mTORC1 & WIPI2 &HUWE1在細(xì)胞自噬中的調(diào)控示意圖
在這里，我們重點(diǎn)展示作者體內(nèi)生理功能的科研成果，這部分研究涉及到模擬磷酸化和非磷酸化突變體的構(gòu)建，而且非常榮幸的是，本部分研究所用AAV產(chǎn)品由維真生物助力。首先，作者饑餓處理小鼠12h&24h，通過Western Blot發(fā)現(xiàn)肝臟中的WIPI2蛋白量增加，而磷酸化的WIPI2卻減少。為了獲得WIPI2磷酸化調(diào)控小鼠肝自噬的直接證據(jù)，作者使用rAAV-WIPI2, rAAV-WIPI2-S395A, or rAAV-WIPI2-S395D腹腔注射小鼠，4周后發(fā)現(xiàn)WIPI2-S395A蛋白量增加，而WIPI2-S395D卻減少；而且，與WT-WIPI2相比，WIPI2-S395A而不是WIPI2-S395D明顯降低了P62和NBR1的蛋白量。此外，腹腔注射rAAV-shHUWE1的小鼠LC3 puncta、WIPI2的蛋白量和P62&NRB1的降解均表現(xiàn)出了增加（圖4）。
圖4：mTORC1介導(dǎo)的WIPI2磷酸化在小鼠肝臟中調(diào)控細(xì)胞自噬
實(shí)驗(yàn)參數(shù)
實(shí)例二 蛋白磷酸化與細(xì)胞遷移、增值和分化
幾乎在同一時間，香港浸會大學(xué)的張老師課題組在Cell Death Discov(IF=4.114)雜志發(fā)表了題為“Oleanolic acid enhances neural stem cell migration, proliferation, and differentiation in vitro by inhibiting GSK3βactivity”研究論文，揭示了齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、增殖和分化，此項(xiàng)工作成果對于治療神經(jīng)退行性疾病具有重要的意義。
首先，作者通過神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)證明OA增加NSCs的遷移；通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了OA促進(jìn)NSCs的增殖；通過western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)揭示了OA促進(jìn)NSCs分化為神經(jīng)元。接著，作者通過分子對接表明GSK3β是OA作用的直接靶基因。最后，作者通過western blot和構(gòu)建非磷酸化突變體（維真生物助力腺病毒）揭示了本論文主題，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。
圖5：齊墩果酸(OA)通過抑制GSK3β活性促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化
[注：Nestin (NSCs marker)；MAP2 (microtubule-associated protein-2, neuron marker)；GFAP(astrocytes marker)]
實(shí)驗(yàn)參數(shù)
維真生物助力蛋白質(zhì)磷酸化研究
維真生物已建成了18000余種人源基因的現(xiàn)貨克隆庫與12000余種人源基因的腺病毒庫，并有蛋白激酶與磷酸酶的克隆子庫，可為您提供蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)基因的克隆與腺病毒；我們還建成了靶向13000余種小鼠基因的gRNA pool 克隆庫，同樣地，我們也有蛋白磷酸化相關(guān)基因的gRNA pool克隆子庫，您可直接包裝AAV，搭配spCas9的轉(zhuǎn)基因小鼠，完成基因在體內(nèi)的精準(zhǔn)調(diào)控，所以如果您有基因喪失方向的實(shí)驗(yàn)需求，這款產(chǎn)品將是您的理想選擇！此外，我們還有靶向700余種人源激酶的gRNA慢病毒文庫，配合CAS9慢病毒或CAS9穩(wěn)定細(xì)胞系，可實(shí)現(xiàn)快速高通量地篩選。不僅如此，我們還可以根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行磷酸化相關(guān)基因的定點(diǎn)突變，并為您提供下游的病毒包裝和基因檢測服務(wù)等。
部分產(chǎn)品與服務(wù)如下：
1、人源蛋白激酶與磷酸酶的現(xiàn)貨克隆子庫
2、鼠源蛋白激酶與磷酸酶的gRNA pool現(xiàn)貨克隆子庫
3、人源蛋白激酶的gRNA慢病毒文庫
4、人源蛋白激酶與磷酸酶的現(xiàn)貨腺病毒
5、蛋白磷酸化相關(guān)基因定點(diǎn)突變、干擾和敲除
6、蛋白磷酸化相關(guān)基因慢病毒、腺病毒、AAV包裝
7、基因的表達(dá)分析服務(wù)...
了解更多產(chǎn)品和服務(wù)，請咨詢當(dāng)?shù)劁N售經(jīng)理或掃碼聯(lián)系您身邊的小V吧！
