關(guān)于慢病毒載體
關(guān)于慢病毒的知識(shí)分享
什么情況下選用慢病毒載體？
慢病毒（Lentivirus）是一類(lèi)改造自人免疫缺陷I型病毒的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是單鏈RNA。區(qū)別于腺病毒和腺相關(guān)病毒，慢病毒能夠介導(dǎo)外源基因整合至宿主基因組，實(shí)現(xiàn)基因長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，是體內(nèi)外基因傳遞的有效工具。
那什么情況下可以選用慢病毒載體呢？
這就需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮吐《镜奶攸c(diǎn)來(lái)進(jìn)行選擇：
1. 如果需要感染的目的細(xì)胞是一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 （如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞）或者是對(duì)腺病毒感染具有較強(qiáng)免疫反應(yīng)的細(xì)胞 （如樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞）時(shí)，可以選擇慢病毒載體，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率及整合至宿主基因組幾率。
2. 慢病毒的宿主范圍廣泛，既能感染分裂細(xì)胞 ，也能感染非分裂細(xì)胞 ，所以體內(nèi)外研究 中均可以選用慢病毒作為病毒載體。如果需要構(gòu)建活體動(dòng)物模型 ，尤其是動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn) ，慢病毒是很好的選擇。
3. 當(dāng)需要將外源基因整合到宿主染色體上，實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定、長(zhǎng)期的表達(dá) 時(shí)，或者后續(xù)需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株 ，那么慢病毒則是理想選擇。
4. 慢病毒載體也可以改造T細(xì)胞用于CAR-T細(xì)胞治療 和基因治療 。與其他病毒載體相比，慢病毒生產(chǎn)成本相對(duì)較低，而且整合模式致癌風(fēng)險(xiǎn)較低，因此用慢病毒載體生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞更加經(jīng)濟(jì)且安全有效。
影響慢病毒感染效率的因素
慢病毒既可以感染分裂細(xì)胞與非分裂細(xì)胞，還能將外源基因整合到宿主染色體上，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的表達(dá)，是體內(nèi)和體外基因傳遞的有效工具。然而慢病毒感染效率受到多種因素的影響，今天就一起分析一下影響慢病毒感染效率的因素：
1. 病毒本身
首先，考慮病毒包裝制備是否存在問(wèn)題 ，比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等。其次，考慮病毒運(yùn)輸和保存方式是否得當(dāng) ，解凍病毒一定要在冰上進(jìn)行，盡量避免反復(fù)凍融，否則會(huì)影響病毒滴度；分裝的病毒-4℃可以保存3天，-80℃保存半年以上需要重新測(cè)定滴度。
2. 細(xì)胞狀態(tài)
細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)是達(dá)到高感染效率的保證，一般選擇細(xì)胞形態(tài)較好、輪廓清晰、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞 進(jìn)行感染可提高感染效率。
3. MOI值
理論上MOI值越大，慢病毒感染上的可能性也越大，感染效率越高，但對(duì)細(xì)胞的毒性也越大（需要的MOI值越大，表明目的細(xì)胞越難被感染，慢病毒對(duì)細(xì)胞的毒性也越大）。所以實(shí)驗(yàn)中可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的MOI值來(lái)達(dá)到相對(duì)較高的細(xì)胞存活率和病毒感染率 。
4. 感染時(shí)間
慢病毒一般在感染后24h換液 。感染后換液太早會(huì)導(dǎo)致感染效率下降;感染后換液太晚，則對(duì)細(xì)胞的損傷太大，效率也不高（如果慢病毒對(duì)細(xì)胞有明顯毒性，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)在4-24h后換液）。由于慢病毒的表達(dá)較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長(zhǎng)，可在感染72~96h后 觀察熒光的表達(dá)。
如何確定合適的慢病毒MOI值？
MOI（multiplicity of infection），即感染復(fù)數(shù)，指的是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。一般認(rèn)為MOI是一個(gè)比值，沒(méi)有單位。合適的MOI值是高感染效率的關(guān)鍵因素之一，那么如何確定合適的MOI值呢？
1. 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，推薦查閱與目的細(xì)胞的種類(lèi)、細(xì)胞狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)條件相似的有參考性的文獻(xiàn)，對(duì)MOI值的適宜范圍有基本的了解。
2. 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，因慢病毒種類(lèi)、實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞狀態(tài)、實(shí)驗(yàn)人員熟練程度等的不同，文獻(xiàn)報(bào)道的MOI值也只能作為參考，推薦正式實(shí)驗(yàn)前在目的細(xì)胞中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)（如梯度實(shí)驗(yàn)）來(lái)摸索合適的MOI值。
3. 選取預(yù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞狀態(tài)較好、熒光較多的孔對(duì)應(yīng)的MOI值作為正式實(shí)驗(yàn)時(shí)使用的MOI值。
下面提供一種慢病毒感染細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)以摸索MOI值的操作步驟以供參考：
慢病毒感染各類(lèi)細(xì)胞的MOI值
別人的慢病毒感染實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的如火如荼，你還在苦苦翻閱文獻(xiàn)查找MOI值？別急，我們來(lái)了！經(jīng)過(guò)大量文獻(xiàn)的查閱，總結(jié)了常用人源、鼠源細(xì)胞的MOI值 供您參考。
慢病毒感染后，為什么細(xì)胞生長(zhǎng)不好？
慢病毒感染后，細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)變差或有大量黑點(diǎn)出現(xiàn)進(jìn)而影響生長(zhǎng) 等問(wèn)題，下面就一起分析一下這些問(wèn)題出現(xiàn)的原因及解決方法：
1.慢病毒感染后，細(xì)胞狀態(tài)很差，甚至出現(xiàn)死亡：
病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素等會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的毒性， 不同細(xì)胞對(duì)毒性的耐受力不同。如果所選擇的目的細(xì)胞對(duì)慢病毒比較敏感，則可能出現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)變差甚至死亡的現(xiàn)象。針對(duì)這種狀況有以下幾點(diǎn)解決方法：一是保證感染前細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)良好；二是使用高純度高滴度的慢病毒，并適當(dāng)降低感染時(shí)使用的MOI值， 即可在細(xì)胞準(zhǔn)備感染時(shí)增加鋪板細(xì)胞的融合率（可提高至70%），調(diào)整感染時(shí)加入的病毒量；三是根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，可選擇在感染4小時(shí)后換液， 用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察。
2.慢病毒感染后細(xì)胞中出現(xiàn)大量黑點(diǎn)，并影響細(xì)胞生長(zhǎng)：
在排除細(xì)菌及真菌污染后，細(xì)胞中的黑點(diǎn)通常為細(xì)胞碎片。在慢病毒感染后，細(xì)胞破碎通常有兩個(gè)原因：a、慢病毒使用量過(guò)多，或細(xì)胞數(shù)量過(guò)少；b、支原體污染。 由于輕度的支原體污染并不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，故支原體污染被許多實(shí)驗(yàn)室所忽略。但支原體在病毒感染細(xì)胞后爆發(fā)，故會(huì)出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片。針對(duì)以上原因建議的解決方法有：一是調(diào)整MOI值，確定合適的病毒使用量；二在使用病毒制品時(shí)，應(yīng)首先排除細(xì)胞、培養(yǎng)物及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染，以保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
助感染試劑 ‖ 提高你的慢病毒感染效率
慢病毒已作為細(xì)胞治療的理想載體得到廣泛應(yīng)用，然而在感染過(guò)程中仍會(huì)出現(xiàn)感染效率低的問(wèn)題，下面就介紹兩種可以提高慢病毒感染效率的助感染試劑，一起來(lái)圍觀吧~
懸浮細(xì)胞是一類(lèi)生長(zhǎng)不依賴(lài)支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)的細(xì)胞。與貼壁細(xì)胞相比，懸浮細(xì)胞難培養(yǎng)，易死亡，且不易轉(zhuǎn)染。維真生物團(tuán)隊(duì)研發(fā)的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑 LVTE 可以解決這一難轉(zhuǎn)染問(wèn)題，其使用原理是增強(qiáng)膜的通透性和細(xì)胞內(nèi)外的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)慢病毒進(jìn)入靶細(xì)胞，進(jìn)而大大提升慢病毒對(duì)懸浮細(xì)胞 這類(lèi)難感染細(xì)胞的感染效率。
使用方法：
（1）直接加入法（適用于較易感染的細(xì)胞類(lèi)型）
①進(jìn)行病毒感染時(shí)，將LVTE稀釋100倍直接加入培養(yǎng)皿/孔/瓶中，混勻即可；
②后續(xù)操作過(guò)程依據(jù)病毒類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需要而定；
（2）離心法（適用于較難感染的細(xì)胞類(lèi)型）
以“24孔培養(yǎng)板、人原代T細(xì)胞”為例：
① 準(zhǔn)備細(xì)胞將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到 24 孔板中，每孔按5×10E5個(gè)待感染細(xì)胞鋪板，每孔400uL培養(yǎng)基；
② 選擇合適的MOI值于24孔板中加入慢病毒，再加入4uL慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)劑LVTE，輕輕混勻，800g室溫離心45min；
③ 離心后將24孔板置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中靜置5-6h；
④ 靜置完成后在培養(yǎng)體系中補(bǔ)加800uL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
⑤ 48-72h后鑒定病毒感染效率。
LVTE在慢病毒感染凍存人原代T細(xì)胞中的效果
維真團(tuán)隊(duì)研發(fā)的 ADV-HR 通過(guò)物理吸附將病毒富集在細(xì)胞表面，從而增加病毒對(duì)細(xì)胞的感染效率，起到助感染的效果，可以提高貼壁細(xì)胞 的病毒感染效率。此試劑既可以用于慢病毒感染，也可以用于腺病毒感染過(guò)程。 高濃度的ADV-HR具有細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞狀態(tài)和感染效率，建議您務(wù)必于目的細(xì)胞中進(jìn)行ADV-HR濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)。
使用方法：
（1）直接加入法（適用于較易感染的細(xì)胞類(lèi)型）
進(jìn)行病毒感染時(shí)，將ADV-HR、慢病毒直接加入培養(yǎng)皿/孔/瓶中，混勻即可。
（2）孵育法（適用于較難感染的細(xì)胞類(lèi)型）
將ADV-HR、慢病毒和一定數(shù)量的細(xì)胞懸液加至1.5mL Eppendorf 管中，輕輕混勻，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5-1個(gè)小時(shí)后轉(zhuǎn)移至預(yù)先加有2ml培養(yǎng)液的6孔板中，37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后續(xù)操作依病毒類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需要而定。
ADV-HR在慢病毒感染HepG2&CNE2中的效果
