關于慢病毒的知識分享

什么情況下選用慢病毒載體？

慢病毒（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷I型病毒的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是單鏈RNA。區(qū)別于腺病毒和腺相關病毒，慢病毒能夠介導外源基因整合至宿主基因組，實現(xiàn)基因長時間穩(wěn)定表達，是體內(nèi)外基因傳遞的有效工具。

那什么情況下可以選用慢病毒載體呢？ 這就需要根據(jù)實驗目的和慢病毒的特點來進行選擇：

1. 如果需要感染的目的細胞是一些難轉(zhuǎn)染的細胞（如原代細胞、干細胞、不分化的細胞）或者是對腺病毒感染具有較強免疫反應的細胞（如樹突狀細胞、單核細胞和間充質(zhì)干細胞）時，可以選擇慢病毒載體，能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導效率及整合至宿主基因組幾率。

2. 慢病毒的宿主范圍廣泛，既能感染分裂細胞，也能感染非分裂細胞，所以體內(nèi)外研究中均可以選用慢病毒作為病毒載體。如果需要構(gòu)建活體動物模型，尤其是動物成瘤實驗，慢病毒是很好的選擇。

3. 當需要將外源基因整合到宿主染色體上，實現(xiàn)目的基因穩(wěn)定、長期的表達時，或者后續(xù)需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，那么慢病毒則是理想選擇。

4. 慢病毒載體也可以改造T細胞用于CAR-T細胞治療和基因治療。與其他病毒載體相比，慢病毒生產(chǎn)成本相對較低，而且整合模式致癌風險較低，因此用慢病毒載體生產(chǎn)CAR-T細胞更加經(jīng)濟且安全有效。

影響慢病毒感染效率的因素

慢病毒既可以感染分裂細胞與非分裂細胞，還能將外源基因整合到宿主染色體上，從而實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達，是體內(nèi)和體外基因傳遞的有效工具。然而慢病毒感染效率受到多種因素的影響，今天就一起分析一下影響慢病毒感染效率的因素：

1. 病毒本身

首先，考慮病毒包裝制備是否存在問題，比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等。其次，考慮病毒運輸和保存方式是否得當，解凍病毒一定要在冰上進行，盡量避免反復凍融，否則會影響病毒滴度；分裝的病毒-4℃可以保存3天，-80℃保存半年以上需要重新測定滴度。

2. 細胞狀態(tài)

細胞良好的生長狀態(tài)是達到高感染效率的保證，一般選擇細胞形態(tài)較好、輪廓清晰、處于對數(shù)生長期的細胞進行感染可提高感染效率。

3. MOI值

理論上MOI值越大，慢病毒感染上的可能性也越大，感染效率越高，但對細胞的毒性也越大（需要的MOI值越大，表明目的細胞越難被感染，慢病毒對細胞的毒性也越大）。所以實驗中可以通過預實驗確定合適的MOI值來達到相對較高的細胞存活率和病毒感染率。

4. 感染時間

慢病毒一般在感染后24h換液。感染后換液太早會導致感染效率下降;感染后換液太晚，則對細胞的損傷太大，效率也不高（如果慢病毒對細胞有明顯毒性，可根據(jù)細胞生長狀態(tài)在4-24h后換液）。由于慢病毒的表達較慢，熒光表達所需時間較長，可在感染72~96h后觀察熒光的表達。

如何確定合適的慢病毒MOI值？

MOI（multiplicity of infection），即感染復數(shù)，指的是感染時病毒與細胞數(shù)量的比值。一般認為MOI是一個比值，沒有單位。合適的MOI值是高感染效率的關鍵因素之一，那么如何確定合適的MOI值呢？

1. 查閱相關文獻，推薦查閱與目的細胞的種類、細胞狀態(tài)、實驗條件相似的有參考性的文獻，對MOI值的適宜范圍有基本的了解。

2. 進行預實驗，因慢病毒種類、實驗條件、細胞狀態(tài)、實驗人員熟練程度等的不同，文獻報道的MOI值也只能作為參考，推薦正式實驗前在目的細胞中進行預實驗（如梯度實驗）來摸索合適的MOI值。

3. 選取預實驗中細胞狀態(tài)較好、熒光較多的孔對應的MOI值作為正式實驗時使用的MOI值。

下面提供一種慢病毒感染細胞的預實驗以摸索MOI值的操作步驟以供參考：

慢病毒感染各類細胞的MOI值

別人的慢病毒感染實驗進行的如火如荼，你還在苦苦翻閱文獻查找MOI值？別急，我們來了！經(jīng)過大量文獻的查閱，總結(jié)了常用人源、鼠源細胞的MOI值供您參考。

慢病毒感染后，為什么細胞生長不好？

慢病毒感染后，細胞可能會出現(xiàn)生長狀態(tài)變差或有大量黑點出現(xiàn)進而影響生長等問題，下面就一起分析一下這些問題出現(xiàn)的原因及解決方法：

1.慢病毒感染后，細胞狀態(tài)很差，甚至出現(xiàn)死亡：

病毒溶液中殘留的雜質(zhì)蛋白、內(nèi)毒素等會對細胞造成一定的毒性，不同細胞對毒性的耐受力不同。如果所選擇的目的細胞對慢病毒比較敏感，則可能出現(xiàn)細胞狀態(tài)變差甚至死亡的現(xiàn)象。針對這種狀況有以下幾點解決方法：一是保證感染前細胞的生長狀態(tài)良好；二是使用高純度高滴度的慢病毒，并適當降低感染時使用的MOI值，即可在細胞準備感染時增加鋪板細胞的融合率（可提高至70%），調(diào)整感染時加入的病毒量；三是根據(jù)細胞狀態(tài)，可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察。

2.慢病毒感染后細胞中出現(xiàn)大量黑點，并影響細胞生長：

在排除細菌及真菌污染后，細胞中的黑點通常為細胞碎片。在慢病毒感染后，細胞破碎通常有兩個原因：a、慢病毒使用量過多，或細胞數(shù)量過少；b、支原體污染。由于輕度的支原體污染并不影響細胞的生長增殖，故支原體污染被許多實驗室所忽略。但支原體在病毒感染細胞后爆發(fā)，故會出現(xiàn)大量細胞碎片。針對以上原因建議的解決方法有：一是調(diào)整MOI值，確定合適的病毒使用量；二在使用病毒制品時，應首先排除細胞、培養(yǎng)物及培養(yǎng)環(huán)境中的支原體污染，以保證實驗的順利進行。

助感染試劑 ‖ 提高你的慢病毒感染效率

慢病毒已作為細胞治療的理想載體得到廣泛應用，然而在感染過程中仍會出現(xiàn)感染效率低的問題，下面就介紹兩種可以提高慢病毒感染效率的助感染試劑，一起來圍觀吧~

1.慢病毒轉(zhuǎn)導增強劑（Lentiviral Transduction Enhancer，LVTE）

懸浮細胞是一類生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長的細胞。與貼壁細胞相比，懸浮細胞難培養(yǎng)，易死亡，且不易轉(zhuǎn)染。維真生物團隊研發(fā)的慢病毒轉(zhuǎn)導增強劑 LVTE 可以解決這一難轉(zhuǎn)染問題，其使用原理是增強膜的通透性和細胞內(nèi)外的跨膜轉(zhuǎn)運，促進慢病毒進入靶細胞，進而大大提升慢病毒對懸浮細胞這類難感染細胞的感染效率。

使用方法：

（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）

①進行病毒感染時，將LVTE稀釋100倍直接加入培養(yǎng)皿/孔/瓶中，混勻即可；

②后續(xù)操作過程依據(jù)病毒類型和實驗需要而定；

（2）離心法（適用于較難感染的細胞類型）

以“24孔培養(yǎng)板、人原代T細胞”為例：

① 準備細胞將狀態(tài)良好的目的細胞接種到 24 孔板中，每孔按5×10E5個待感染細胞鋪板，每孔400uL培養(yǎng)基；

② 選擇合適的MOI值于24孔板中加入慢病毒，再加入4uL慢病毒轉(zhuǎn)導增強劑LVTE，輕輕混勻，800g室溫離心45min；

③ 離心后將24孔板置于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中靜置5-6h；

④ 靜置完成后在培養(yǎng)體系中補加800uL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

⑤ 48-72h后鑒定病毒感染效率。

LVTE在慢病毒感染凍存人原代T細胞中的效果
（左圖：未添加LVTE 右圖：添加LVTE）

2.慢病毒/腺病毒助感染試劑（ADV-HR）

維真團隊研發(fā)的 ADV-HR 通過物理吸附將病毒富集在細胞表面，從而增加病毒對細胞的感染效率，起到助感染的效果，可以提高貼壁細胞的病毒感染效率。此試劑既可以用于慢病毒感染，也可以用于腺病毒感染過程。高濃度的ADV-HR具有細胞毒性，影響細胞狀態(tài)和感染效率，建議您務必于目的細胞中進行ADV-HR濃度梯度預實驗。

使用方法：

（1）直接加入法（適用于較易感染的細胞類型）

進行病毒感染時，將ADV-HR、慢病毒直接加入培養(yǎng)皿/孔/瓶中，混勻即可。

（2）孵育法（適用于較難感染的細胞類型）

將ADV-HR、慢病毒和一定數(shù)量的細胞懸液加至1.5mL Eppendorf 管中，輕輕混勻，置于37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育0.5-1個小時后轉(zhuǎn)移至預先加有2ml培養(yǎng)液的6孔板中，37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。后續(xù)操作依病毒類型和實驗需要而定。

ADV-HR在慢病毒感染HepG2&CNE2中的效果