關于AAV載體

腺相關病毒載體（一）

腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一種單鏈DNA復制缺陷型細小病毒，它的生命周期依賴于復制病毒的參與。AAV基因組大小為4.7 kb，由末端反向重復序列ITR和中間的rep、cap基因組成。ITRs對于病毒的復制和包裝具有重要作用；rep基因編碼參與病毒復制、包裝和基因組整合的非結構蛋白，cap基因編碼結構蛋白VP1、VP2和VP3，3種蛋白分別按1:1:10的比例組裝形成病毒衣殼，充當病毒基因傳遞載體。此外，cap基因內(nèi)嵌套的另一個開放閱讀框編碼裝配激活蛋白AAP，參與衣殼蛋白的靶向和裝配。

AAV轉導細胞主要經(jīng)歷了細胞表面受體介導的內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼和雙鏈轉化幾個過程。進入細胞后，可以在輔助病毒的存在下進入其復制周期。

AAV轉導細胞過程

重組AAV載體可以通過將內(nèi)源性的rep和cap基因替換為一個表達盒，該表達盒由一個啟動子驅動一個感興趣的轉基因和一個poly（A）尾巴組成。通過包裝質(zhì)粒反式提供rep和cap基因以及腺病毒輔助質(zhì)粒來包裝載體。病毒編碼序列的完全去除使AAV的包裝能力最大化（包裝容量為4.5Kb），并且有助于它們在體內(nèi)遞送時的低免疫原性和細胞毒性。

重組AAV載體

基因工程化的AAV能轉導外源基因，借助特定啟動子、光遺傳學/化學遺傳學元件、鈣指示劑、神經(jīng)遞質(zhì)探針或Cre/lox P，F(xiàn)lp／FRT重組酶技術，可選擇性地標記特定的神經(jīng)元。重組AAV基因傳遞效果好、缺乏致病性和安全性高、宿主細胞范圍廣、在體內(nèi)表達時間長，是目前最有前途和最成功的基因治療載體之一。

腺相關病毒載體（二）

現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類靈長動物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結構、序列和組織特異性，因而其識別與結合的細胞表面受體也相應有很大差別，這也導致不同血清型轉染的組織類型、細胞類型和感染效率也各不相同。

已批準用于商業(yè)用途的：AAV1和AAV2；

臨床使用頻率最高的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；

AAV8，AAV9：靶向全身的多種肌肉類型；

幾乎所有天然AAV衣殼都可以在全身給藥后有效地轉到肝臟；

人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體

AAV1至AAV9的不同組織親噬性

怎樣實現(xiàn)器官/細胞特異的表達？

1. 局部注射，直接在想表達的地方注射 rAAV ，適合器官水平特異感染，容易操作。

2. 使用組織/器官特異啟動子來表達外源基因包裝 rAAV， rAAV 即使感染了其他組織也由于特異性啟動子而不會在其他組織中表達。

3.Cre-on，F(xiàn)lex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統(tǒng)，經(jīng)過兩次染色體重組在特定臟器中表達外源基因。

ssAAV & scAAV

目前，研究人員常用的兩類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基于2個基礎被開發(fā)的：一個是理論基礎：無論scAAV還是rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體，甚至四倍體的AAV基因組DNA；一個是結構基礎：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結構)。ssAAV包裝基因組正義鏈和反義鏈的幾率一樣。ssAAV在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉化，才能啟動基因轉錄過程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核后即可啟動基因轉錄，跨過了雙鏈轉化的步驟，從而實現(xiàn)外源基因的快速表達。

ssAAV和scAAV向靶細胞中遞送外源基因的過程：

組織特異性AAV的選擇

AAV血清型種類眾多，其衣殼蛋白氨基酸序列、結構以及它們與宿主細胞因子相互作用的差異性導致不同血清型AAV對不同的組織和細胞感染效率不同，使用AAV作為載體工具時，應選擇組織特異性強 的血清型/變體，提高其轉導效率。

現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類靈長動物AAV血清型。下面列舉了人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體及不同組織親嗜性，可根據(jù)組織類型選擇合適的AAV血清型。在選擇血清型時，盡量選擇對靶組織和細胞有更高特異性和轉導效率的AAV。

AAV注射方式如何選擇？

在利用AAV進行研究尤其是進行體內(nèi)實驗時,需要將AAV通過不同的方法遞送到體內(nèi)才能發(fā)揮作用，AAV注射方式會大大影響AAV介導的轉基因的效率，因此，在確定好合適的AAV血清型、啟動子等條件后，配以合適的AAV給藥方式會取得更好的效果。

按注射部位，可分為全身給藥、局部給藥和口服給藥。

01全身給藥主要分為靜脈注射和動脈注射；靜脈注射又分為尾靜脈注射和門靜脈注射等；

02局部給藥主要分為肌內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射、腦部注射、玻璃體注射、鼻腔吸入等；

03口服給藥，在消化道局部性疾病動物模型中已取得成功，在全身性疾病（糖尿病、貧血等）基因治療研究同樣取得了顯著的療效。然而口服AAV基因藥物在基因治療中仍然面臨藥物傳輸上的挑戰(zhàn)，如胃腸道中的DNA酶的降解作用、體內(nèi)體液屏障等。

在具體實驗中可以根據(jù)不同的注射部位和實驗目的選擇合適的給藥方式，在此，簡單歸納了常見注射部位的給藥方式供大家參考。

為什么你的AAV病毒感染效率不高？

重組腺相關病毒（rAAV）是目前廣泛使用的基因轉導及基因治療工具，它可以將DNA分子轉導到分裂細胞及終末分化細胞中，并維持基因的相對長效表達。但實際應用時可能會發(fā)現(xiàn)目的基因沒有表達或者沒有達到預想效果，此時，我們可以從以下幾個方面來進行分析：

一、考慮病毒本身的問題：

首先，病毒包裝制備是否存在問題（比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等），其次，病毒運輸和保存方式是否得當（雖然AAV病毒比較穩(wěn)定，但仍建議避免反復凍融對病毒滴度帶來的不利影響）。

二、考慮組織特異性的問題：

前幾期我們已經(jīng)介紹過，AAV血清型『組織特異性AAV的選擇』、啟動子『AAV應用之組織特異性啟動子的選擇』、注射方式『AAV注射方式如何選擇？』以及注射量都是影響AAV病毒感染效率的重要因素。如果AAV感染細胞或進行動物注射后沒有檢測到表達或者表達效果不好，可以綜合考慮以上因素進行優(yōu)化。

三、考慮檢測時間的問題：

通常情況下，AAV在體內(nèi)表達需要1-2周的時間，表達時間一般能持續(xù)半年或更久。如果檢測時間過早，可能達不到理想的效果。如果想要實現(xiàn)更快的表達，可以根據(jù)基因大小和具體實驗需求等選擇scAAV，scAAV較ssAAV表達速度更快，且能實現(xiàn)更高水平的表達。

四、考慮檢測方式的問題：

1、目的基因的mRNA和蛋白表達一般通過qRT-PCR和Western Blot方法進行檢測。組織的裂解及RNA或蛋白的提取是否充分等因素應該被考慮。

2、如果載體上添加了熒光標簽，進行免疫熒光染色分析時，應考慮組織細胞固定的及時性或組織樣本切片制備的過程中熒光蛋白的穩(wěn)定性等因素。在選擇檢測方法時，我們通常建議采用多種檢測方式對病毒和基因表達的情況進行檢測。

五、考慮其他因素：

除以上幾種因素外，實驗人員的操作手法是否嫻熟、選用的實驗細胞/動物是否滿足實驗需求等也是影響實驗成功與否的關鍵因素。此外，建議在正式實驗前進行多次預實驗以期達到更好的實驗效果。