關(guān)于A(yíng)AV載體

腺相關(guān)病毒載體（一）

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一種單鏈DNA復(fù)制缺陷型細(xì)小病毒，它的生命周期依賴(lài)于復(fù)制病毒的參與。AAV基因組大小為4.7 kb，由末端反向重復(fù)序列ITR和中間的rep、cap基因組成。ITRs對(duì)于病毒的復(fù)制和包裝具有重要作用；rep基因編碼參與病毒復(fù)制、包裝和基因組整合的非結(jié)構(gòu)蛋白，cap基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，3種蛋白分別按1:1:10的比例組裝形成病毒衣殼，充當(dāng)病毒基因傳遞載體。此外，cap基因內(nèi)嵌套的另一個(gè)開(kāi)放閱讀框編碼裝配激活蛋白AAP，參與衣殼蛋白的靶向和裝配。

AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞主要經(jīng)歷了細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、逃離內(nèi)體、入核、脫衣殼和雙鏈轉(zhuǎn)化幾個(gè)過(guò)程。進(jìn)入細(xì)胞后，可以在輔助病毒的存在下進(jìn)入其復(fù)制周期。

AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程

重組AAV載體可以通過(guò)將內(nèi)源性的rep和cap基因替換為一個(gè)表達(dá)盒，該表達(dá)盒由一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)一個(gè)感興趣的轉(zhuǎn)基因和一個(gè)poly（A）尾巴組成。通過(guò)包裝質(zhì)粒反式提供rep和cap基因以及腺病毒輔助質(zhì)粒來(lái)包裝載體。病毒編碼序列的完全去除使AAV的包裝能力最大化（包裝容量為4.5Kb），并且有助于它們?cè)隗w內(nèi)遞送時(shí)的低免疫原性和細(xì)胞毒性。

重組AAV載體

基因工程化的AAV能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因，借助特定啟動(dòng)子、光遺傳學(xué)/化學(xué)遺傳學(xué)元件、鈣指示劑、神經(jīng)遞質(zhì)探針或Cre/lox P，F(xiàn)lp／FRT重組酶技術(shù)，可選擇性地標(biāo)記特定的神經(jīng)元。重組AAV基因傳遞效果好、缺乏致病性和安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣、在體內(nèi)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)，是目前最有前途和最成功的基因治療載體之一。

腺相關(guān)病毒載體（二）

現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類(lèi)AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類(lèi)靈長(zhǎng)動(dòng)物AAV血清型。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識(shí)別與結(jié)合的細(xì)胞表面受體也相應(yīng)有很大差別，這也導(dǎo)致不同血清型轉(zhuǎn)染的組織類(lèi)型、細(xì)胞類(lèi)型和感染效率也各不相同。

已批準(zhǔn)用于商業(yè)用途的：AAV1和AAV2；

臨床使用頻率最高的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；

AAV8，AAV9：靶向全身的多種肌肉類(lèi)型；

幾乎所有天然AAV衣殼都可以在全身給藥后有效地轉(zhuǎn)到肝臟；

人類(lèi)AAV1至AAV9識(shí)別的細(xì)胞表面受體

AAV1至AAV9的不同組織親噬性

怎樣實(shí)現(xiàn)器官/細(xì)胞特異的表達(dá)？

1. 局部注射，直接在想表達(dá)的地方注射 rAAV ，適合器官水平特異感染，容易操作。

2. 使用組織/器官特異啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)外源基因包裝 rAAV， rAAV 即使感染了其他組織也由于特異性啟動(dòng)子而不會(huì)在其他組織中表達(dá)。

3.Cre-on，F(xiàn)lex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)兩次染色體重組在特定臟器中表達(dá)外源基因。

ssAAV & scAAV

目前，研究人員常用的兩類(lèi)AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基于2個(gè)基礎(chǔ)被開(kāi)發(fā)的：一個(gè)是理論基礎(chǔ)：無(wú)論scAAV還是rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體，甚至四倍體的AAV基因組DNA；一個(gè)是結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)：wtAAV ITR序列的特殊性(T型結(jié)構(gòu))。ssAAV包裝基因組正義鏈和反義鏈的幾率一樣。ssAAV在入核、脫衣殼后，需要借助宿主DNA聚合酶或者分子間退火完成雙鏈轉(zhuǎn)化，才能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程，而scAAV中已存在雙鏈，它入核后即可啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，跨過(guò)了雙鏈轉(zhuǎn)化的步驟，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的快速表達(dá)。

ssAAV和scAAV向靶細(xì)胞中遞送外源基因的過(guò)程：

組織特異性AAV的選擇

AAV血清型種類(lèi)眾多，其衣殼蛋白氨基酸序列、結(jié)構(gòu)以及它們與宿主細(xì)胞因子相互作用的差異性導(dǎo)致不同血清型AAV對(duì)不同的組織和細(xì)胞感染效率不同，使用AAV作為載體工具時(shí)，應(yīng)選擇組織特異性強(qiáng) 的血清型/變體，提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。

現(xiàn)階段研究人員已發(fā)現(xiàn)12種人類(lèi)AAV 血清型（AAV1至AAV12）和 100多種非人類(lèi)靈長(zhǎng)動(dòng)物AAV血清型。下面列舉了人類(lèi)AAV1至AAV9識(shí)別的細(xì)胞表面受體及不同組織親嗜性，可根據(jù)組織類(lèi)型選擇合適的AAV血清型。在選擇血清型時(shí)，盡量選擇對(duì)靶組織和細(xì)胞有更高特異性和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的AAV。

AAV注射方式如何選擇？

在利用AAV進(jìn)行研究尤其是進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí),需要將AAV通過(guò)不同的方法遞送到體內(nèi)才能發(fā)揮作用，AAV注射方式會(huì)大大影響AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因的效率，因此，在確定好合適的AAV血清型、啟動(dòng)子等條件后，配以合適的AAV給藥方式會(huì)取得更好的效果。

按注射部位，可分為全身給藥、局部給藥和口服給藥。

01全身給藥主要分為靜脈注射和動(dòng)脈注射；靜脈注射又分為尾靜脈注射和門(mén)靜脈注射等；

02局部給藥主要分為肌內(nèi)注射、腫瘤內(nèi)注射、腦部注射、玻璃體注射、鼻腔吸入等；

03口服給藥，在消化道局部性疾病動(dòng)物模型中已取得成功，在全身性疾?。ㄌ悄虿?、貧血等）基因治療研究同樣取得了顯著的療效。然而口服AAV基因藥物在基因治療中仍然面臨藥物傳輸上的挑戰(zhàn)，如胃腸道中的DNA酶的降解作用、體內(nèi)體液屏障等。

在具體實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)不同的注射部位和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的給藥方式，在此，簡(jiǎn)單歸納了常見(jiàn)注射部位的給藥方式供大家參考。

為什么你的AAV病毒感染效率不高？

重組腺相關(guān)病毒（rAAV）是目前廣泛使用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因治療工具，它可以將DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)到分裂細(xì)胞及終末分化細(xì)胞中，并維持基因的相對(duì)長(zhǎng)效表達(dá)。但實(shí)際應(yīng)用時(shí)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)目的基因沒(méi)有表達(dá)或者沒(méi)有達(dá)到預(yù)想效果，此時(shí)，我們可以從以下幾個(gè)方面來(lái)進(jìn)行分析：

一、考慮病毒本身的問(wèn)題：

首先，病毒包裝制備是否存在問(wèn)題（比如外源基因是否正確，病毒滴度是否合格等），其次，病毒運(yùn)輸和保存方式是否得當(dāng)（雖然AAV病毒比較穩(wěn)定，但仍建議避免反復(fù)凍融對(duì)病毒滴度帶來(lái)的不利影響）。

二、考慮組織特異性的問(wèn)題：

前幾期我們已經(jīng)介紹過(guò)，AAV血清型『組織特異性AAV的選擇』、啟動(dòng)子『AAV應(yīng)用之組織特異性啟動(dòng)子的選擇』、注射方式『AAV注射方式如何選擇？』以及注射量都是影響AAV病毒感染效率的重要因素。如果AAV感染細(xì)胞或進(jìn)行動(dòng)物注射后沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)或者表達(dá)效果不好，可以綜合考慮以上因素進(jìn)行優(yōu)化。

三、考慮檢測(cè)時(shí)間的問(wèn)題：

通常情況下，AAV在體內(nèi)表達(dá)需要1-2周的時(shí)間，表達(dá)時(shí)間一般能持續(xù)半年或更久。如果檢測(cè)時(shí)間過(guò)早，可能達(dá)不到理想的效果。如果想要實(shí)現(xiàn)更快的表達(dá)，可以根據(jù)基因大小和具體實(shí)驗(yàn)需求等選擇scAAV，scAAV較ssAAV表達(dá)速度更快，且能實(shí)現(xiàn)更高水平的表達(dá)。

四、考慮檢測(cè)方式的問(wèn)題：

1、目的基因的mRNA和蛋白表達(dá)一般通過(guò)qRT-PCR和Western Blot方法進(jìn)行檢測(cè)。組織的裂解及RNA或蛋白的提取是否充分等因素應(yīng)該被考慮。

2、如果載體上添加了熒光標(biāo)簽，進(jìn)行免疫熒光染色分析時(shí)，應(yīng)考慮組織細(xì)胞固定的及時(shí)性或組織樣本切片制備的過(guò)程中熒光蛋白的穩(wěn)定性等因素。在選擇檢測(cè)方法時(shí)，我們通常建議采用多種檢測(cè)方式對(duì)病毒和基因表達(dá)的情況進(jìn)行檢測(cè)。

五、考慮其他因素：

除以上幾種因素外，實(shí)驗(yàn)人員的操作手法是否嫻熟、選用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞/動(dòng)物是否滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求等也是影響實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素。此外，建議在正式實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行多次預(yù)實(shí)驗(yàn)以期達(dá)到更好的實(shí)驗(yàn)效果。