病毒包裝-AAV注射肺部
『病毒包裝-AAV感染肺部』- 鼻內(nèi)滴注法
鼻內(nèi)滴注法是一種直接的AAV感染法，操作簡單且對設(shè)備要求低，對新手實(shí)驗(yàn)員也同樣適用。缺點(diǎn)是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇和咽）和胃腸道，如果需要有效地感染到下呼吸道，則可能需要更大劑量的AAV才能實(shí)現(xiàn)。
圖1. 鼻內(nèi)滴注AAV（兩種操作手法）
（van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019.）（ Santry, L.A., et al.BMC Biotechnol, 2017.）
鼻內(nèi)滴注AAV-操作步驟：
（1）腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：為了保持小鼠穩(wěn)定的呼吸頻率，不應(yīng)過度麻醉。
（2）甲按圖1所示兩種方法將小鼠控制好，防止其用嘴呼吸；
（3）乙緩慢滴一滴AAV懸液于小鼠鼻孔內(nèi)壁，待液體被吸入后再滴下一滴，重復(fù)此操作至40μL AAV懸液全部滴完；
（4）使小鼠保持上述姿勢約30~60s，以便AAV懸液充分進(jìn)入下呼吸道；
（5）待小鼠在籠中恢復(fù)10min后，重復(fù)上述操作，再次給藥40μL（每只小鼠共給藥80μL）；
（6）將小鼠放回籠中直至完全清醒。
『病毒包裝-AAV感染肺部』- 氣管插管術(shù)
口腔氣管插管術(shù)能夠?qū)⒉《据d體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術(shù)的風(fēng)險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達(dá)肺內(nèi)，所以要嚴(yán)格控制AAV的使用量。同時，與鼻內(nèi)滴注法相比，口腔氣管插管術(shù)需要一些特殊設(shè)備，操作起來也稍有難度。
圖2. 氣管內(nèi)注射AAV （van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019. ）
操作步驟：
（1）腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：動物必須處于足夠深的麻醉狀態(tài)以防止運(yùn)動或?qū)d體的反應(yīng)而打噴嚏或咳嗽；
（2）將小鼠放在垂直支架上，將門牙環(huán)置于小鼠上門牙上，讓老鼠的腹部面向自己；
（3）輕輕地把小鼠舌頭拉出來，并用拇指和食指按住，中指放在小鼠頸部和塑料支架之間；
（4）用食指、拇指在小鼠舌上牽引令其嘴張開，使插管路徑伸直，并用中指在頸后調(diào)整頭部角度；
（5）利用光纖作為光源和引導(dǎo)者，推動它通過可視聲帶（如果看不到聲帶，用中指作支撐，輕輕用力拉舌）；
（6）光纖插入后，同時將導(dǎo)管向前推進(jìn)約5mm，然后勿移動導(dǎo)管，取出光纖；
（7）使小鼠平躺，用膠帶將導(dǎo)管固定在小鼠嘴部防止其移動，另一端用橡皮泥支撐；
（8）用注射器通過導(dǎo)管輸入80μL AAV； 注意：在抽取80μL載體之前，吸取約100μL的空氣至移液管尖，以防止載體的丟失，并促進(jìn)載體深入肺部；
（9）等待5min，使AAV充分進(jìn)入下呼吸道；
（10）把導(dǎo)管移出，將小鼠輕輕從工作臺拿下，并將頭部和胸部用折疊的紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的呼吸；
（11）將小鼠放回籠中直至完全清醒。
『病毒包裝-AAV感染肺部』- 氣管內(nèi)注射
與鼻內(nèi)滴注相比，氣管內(nèi)注射能夠提高AAV進(jìn)入肺部的效率；與口腔氣管插管法相比，設(shè)備更簡單，操作更容易。然而，氣管內(nèi)注射具有極高的外科手術(shù)風(fēng)險，包括出血、切口開裂、感染以及較長的恢復(fù)期等。不僅如此，由于小鼠氣管窄小，很容易出現(xiàn)操作失誤，將AAV注射到氣管周圍組織或食管中去。
操作步驟：
（1）腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
（2）將小鼠以背臥姿勢固定在嚙齒動物工作臺上，并將其前爪伸直固定；
（3）剃除頸部部分區(qū)域的鼠毛，并用碘伏做消毒處理；
（4）用手術(shù)剪刀在頸部做一個5~7mm的小切口；
（5）手握鑷子固定住小鼠氣管，另一只手握住注射器，使注射器針頭斜面朝上，與氣管成45°。
注意：一旦針頭插入，輕輕地將針頭向外移動，遠(yuǎn)離小鼠身體，確定針頭是否正確地插入氣管。
（6）將40~80μL 的AAV緩慢注入氣管，等待5s后慢慢取出針管；
（7）縫合傷口，將小鼠放回籠中恢復(fù)，直到完全清醒。
『病毒包裝-AAV感染腎臟』- 經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射
經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射后，基因表達(dá)分布在腎臟管道系統(tǒng)，可以克服腎小球屏障限制，但注射較難，技術(shù)挑戰(zhàn)性較大，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)際情況選擇合適的注射方式。下面來分享一下經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射的操作手法：
經(jīng)輸尿管腎盂逆行注射的操作方式：
① 對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
② 在小鼠左腹部做一個切口并輕輕剖開，找到輸尿管遠(yuǎn)端和腎動脈并用顯微止血夾夾住；
③ 用 30G注射針刺破輸尿管，將注射針貼合于管壁并固定到位，使用 6-0縫線縫合以防液體泄漏；
④ 將尿液輕輕吸出，將注射器替換為另一個含有約 50ul液體（含有 5*10E10個病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或PBS）的注射器，并緩慢地將液體逆行注入輸尿管；
⑤ 將注射針撤出，并在注射部位的近端放置一個顯微止血夾以防液體泄漏；
⑥ 5min后，移去輸尿管遠(yuǎn)端、近端及腎動脈上的顯微止血夾，用6-0縫線將切口分兩層縫合。
『病毒包裝-AAV感染腎臟』- 經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射
經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射后，基因表達(dá)分布在皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎小管上皮細(xì)胞中，主要是集合管細(xì)胞。此方法是一種新的注射方式，操作簡單，基因表達(dá)穩(wěn)定。下面分享一下經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射的操作方式供參考：
經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射的操作方式：
① 對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
② 對小鼠左腹進(jìn)行剃毛處理，切開一個2cm的切口暴露左腎和輸尿管，并將周圍器官和脂肪輕輕分開；
③ 用顯微止血夾夾住輸尿管上段以阻止病毒原液下流至膀胱；
④ 用30G注射針刺入左腎中極的腎盂（注意注射針頭不應(yīng)刺穿腎盂），將50μL液體（含5*10E10個病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或PBS）注入腎盂；
注：注射針刺入腎盂而不刺穿腎盂的關(guān)鍵在于注意比對穿刺針和小鼠腎臟，并且在注射針上做好標(biāo)記；
⑤ 5min后移去顯微止血夾，將切口分兩層縫合。
『病毒包裝-AAV感染腎臟』- 腎靜脈注射
哺乳動物的腎臟具有嚴(yán)格的過濾功能，排斥大于50kDa的蛋白質(zhì)，此外，腎小球內(nèi)的足細(xì)胞形成直徑僅為10nm的狹縫橫膈膜，傳統(tǒng)的AAV載體全身給藥難以在腎臟達(dá)到足夠的表達(dá)水平，即便是高劑量給藥也會導(dǎo)致AAV集中在肝臟等腎外器官中。為了提高病毒載體對腎臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)并降低病毒載體對腎外器官的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，除了全身給藥方式外，近年來，科學(xué)家陸續(xù)開發(fā)了腎臟局部給藥途徑包括腎動脈注射、腎靜脈注射、經(jīng)腎實(shí)質(zhì)注射、經(jīng)輸尿管逆行給藥和經(jīng)腎實(shí)質(zhì)腎盂注射等(圖1)。
圖3. 腎臟AAV給藥方式
(A) 腎動脈灌注，通過導(dǎo)管或注射器；(B)腎靜脈逆行灌注；(C)逆行輸尿管灌注；(D)經(jīng)腎囊壁直接向腎實(shí)質(zhì)注射。
（Rubin, J.D. and M.A. Barry. Mol Diagn Ther, 2020.）
腎靜脈注射的操作方式：
攜帶目的基因的病毒載體通過腎靜脈注射后，基因可在皮質(zhì)和髓質(zhì)中表達(dá)，主要在腎小球和近端小管中表達(dá)，但難以突破腎小球屏障，效率較低。下面就來分享一下腎靜脈注射的操作方式：
① 對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進(jìn)行麻醉手術(shù)，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺上；
② 給小鼠左腹剃毛，在小鼠左腹部做一個切口，暴露左腎及腎蒂，并將腎靜脈從腎蒂中游離；
③ 用顯微止血夾夾住腎靜脈遠(yuǎn)端以阻止病毒原液流出腎臟；
④ 用30G注射針刺入左腎靜脈近端，將50μl液體（含有 5*10E10個病毒顆?；蚪M拷貝數(shù)或 PBS）注入腎靜脈；
⑤ 5min后，拔出注射針，移去顯微止血夾并壓迫止血片刻，將切口分兩層縫合。
『病毒包裝-AAV感染肝臟』- 肝門靜脈注射
AAV在肝臟中的注射方式分為直接傳送和外周傳送兩種（下表所示），直接傳送靶向性高但侵入性強(qiáng)且對實(shí)驗(yàn)技能要求高，外周傳送操作簡單但靶向性稍差，操作者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的注射方式。
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注射
方式
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覆蓋
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優(yōu)點(diǎn)
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缺點(diǎn)
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直接
傳送
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肝葉注射、門靜脈注射、脾包膜注射；肝動脈注射（大動物與人）；
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克服了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題，靶向性高，所需病毒量少；
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侵入性強(qiáng)，風(fēng)險大，實(shí)驗(yàn)操作技能要求高；
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外周
傳送
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腹腔注射和靜脈注射（尾靜脈注射和眶后靜脈竇注射等）；
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操作簡單，無須手術(shù)或麻醉；
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靶向性較直接傳送稍差，可能需要較多的注射體積；
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下面來介紹一下直接傳送方式中肝門靜脈注射的操作手法：
01
通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理；
02
在距劍突軟骨下方2-3mm處，做一個2-3cm的中線切口。
03
暴露門靜脈，使用30G針頭在1min內(nèi)均勻緩慢注射0.2 ml病毒懸液。
注：門靜脈是一種相對較大的靜脈，提起肝前葉一般即可看到門靜脈。在手術(shù)過程中，用浸泡在生理鹽水中的無菌紗布覆蓋腸道，保持腸道濕潤。
04
注射后保持針位約10-20秒。取出針后，做好防出血處理；
05
縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復(fù)意識。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng)，直到傷口完全愈合。
圖4. 小鼠肝臟門靜脈、肝動脈示意圖
『病毒包裝-AAV感染肝臟』- 肝內(nèi)注射
肝內(nèi)注射可以克服轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題，靶向性高，所需病毒量少；缺點(diǎn)則是侵入性強(qiáng)，風(fēng)險大，實(shí)驗(yàn)操作技能要求高，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的操作方式。下圖為小鼠肝臟AAV給藥途徑示意圖：
圖5. 小鼠仰臥位圖，顯示非手術(shù)腹膜內(nèi)和手術(shù)肝內(nèi)、脾內(nèi)和門靜脈輸送路徑
（Palaschak, B., R.W. Herzog and D.M. Markusic, Methods Mol Biol, 2019.）
操作手法：
01 通過腹腔注射麻醉劑將成年小鼠麻醉，對小鼠腹部局部區(qū)域做去毛及消毒處理；
02 在距劍突軟骨下方2-3mm，做一個2-3cm的中線切口，以露出肝臟。
03 用固定在結(jié)核菌素注射器上的30G針頭將病毒懸液緩慢注入肝實(shí)質(zhì)中。
注：在注射過程中通過手術(shù)立體鏡監(jiān)測注射部位，確保無出血或外滲。如果出現(xiàn)上述任何一種情況，需取出針頭，輕輕按壓止血，然后選擇一個新的部位進(jìn)行注射。
04 取出針，用無菌紗布輕輕按壓止血。
05 再選擇其他部位進(jìn)行注射。
06 縫合腹部，將小鼠放置于加熱燈下，直至恢復(fù)意識。然后將其放回籠子單獨(dú)飼養(yǎng)，直到傷口完全愈合。
注：一只成年小鼠一次可選擇4 ~ 5個不同的注射位點(diǎn)(40 ~ 50μl/site)，總劑量可達(dá)200μl。
『病毒包裝-AAV感染肝臟』- 靜脈注射
肝臟對全身應(yīng)用AAV有較高的親和性，使用外周傳遞方式如靜脈注射，配合AAV8等肝臟嗜性較強(qiáng)的血清型以及TBG等肝臟特異性啟動子也可以較好的將目的基因遞送到肝臟進(jìn)行表達(dá)，操作方式簡單且對動物侵入性傷害較小。
圖6. （A）小鼠側(cè)視圖，顯示側(cè)尾靜脈或眶靜脈竇注射路線
（Palaschak, B.,R.W. Herzog and D.M. Markusic, Methods Mol Biol, 2019.）
今天介紹一下尾靜脈注射和新生小鼠靜脈注射的操作手法：
1. 尾靜脈注射
將小鼠放在標(biāo)準(zhǔn)限制器中，使注射器能夠完全接觸到整個尾巴長度。
將一根30G的針頭固定在1cc結(jié)核菌素注射器上，盡可能遠(yuǎn)的插入尾部側(cè)面靜脈。選擇一個遠(yuǎn)端部位，如果第一次注射失敗，可以選擇另一個更近端的注射部位。
注：a：小鼠尾巴上較容易接觸到的靜脈位于尾巴的側(cè)面，且側(cè)靜脈非常淺，無需進(jìn)針很深；小鼠尾部背面的靜脈很難常規(guī)注射；尾部腹面的血管是動脈，不可注射。b：注射前用溫水輕輕地加熱尾巴，可以使血管得到一定程度的舒張，便于注射。
注射完成后取下針頭，輕輕按壓止血，然后立即將小鼠放回籠中。
注：使用此方法注射成年小鼠，病毒用量控制在300 -400μl較佳。
2. 新生小鼠靜脈注射
需兩個人配合完成，一人固定，一人注射；
注射前將小鼠置于干毛巾上，減少活動及損傷；
一人輕輕固定小鼠，使側(cè)面朝上，暴露眼睛至頸部的顳淺靜脈，置于放大鏡下；
另一人沿著自頭至頸的方向?qū)?0G的注射針頭插入靜脈旁的皮下，慢慢推進(jìn)靜脈（新生鼠皮膚呈現(xiàn)半透明，較易觀察）；
慢慢注射病毒懸液；（如果注射成功，注射部位遠(yuǎn)端靜脈會呈白色，如果未成功，皮下注射10μl即可看到明顯的隆起）
注射完成后，取下針頭，輕輕按壓靜脈，通常2-3分鐘會停止出血；
將新生鼠在加熱燈下照射后，放回母鼠身邊；
如果注射不成功，讓小鼠恢復(fù)5-10分鐘，然后在另一側(cè)嘗試第二次注射；
注：使用此方法注射新生小鼠，病毒用量控制在100μl以內(nèi)較佳。
『病毒包裝-AAV感染眼睛』- 視網(wǎng)膜下注射
視網(wǎng)膜下注射（SR）是將藥物注入光感受器細(xì)胞和RPE之間的視網(wǎng)膜下腔，這需要使視網(wǎng)膜的神經(jīng)上皮層與色素上皮層分離，形成視網(wǎng)膜下腔。SR是將基因直接遞送至RPE細(xì)胞或光感受器細(xì)胞的有效方法，但此方法侵入性較大，容易使視網(wǎng)膜脫離，可能會引起膠質(zhì)細(xì)胞增生、光感受器退化及視力功能損傷等，并且藥物擴(kuò)散有限只能實(shí)現(xiàn)局部轉(zhuǎn)導(dǎo)。
視網(wǎng)膜下腔注射，主要轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞，不會觸發(fā)體液免疫反應(yīng)，對另一只眼再次視網(wǎng)膜下注射也無影響。
圖7. 視網(wǎng)膜下注射方式
(https://www.pharmacology.cup.uni-muenchen.de/research/retinal_gene_therapy/index.html)
小鼠視網(wǎng)膜下腔注射步驟：
1、麻醉：對于成年小鼠，異氟醚吸入麻醉或聯(lián)合使用氯胺酮（100mg/ml）和賽拉嗪(20mg/ml)按照0.1ml/10g腹腔注射; 對于圍產(chǎn)期小鼠，異氟烷吸入麻醉或低溫麻醉；
2、使用Vannas直剪沿著閉合的眼瞼裂開大約1.5 mm的切口；注意切口不要太大；
3、用彎曲的敷料鉗將眼皮分開，以支撐眼睛，并在眼睛下方稍微捏緊眼皮，將其拿起以供注射；
4、在眼球中緯線或中緯線后方做一個小的鞏膜切口，切口夠注射針尖端通過即可；
5、小心地將注射針插入切口部位，并平行于眼外壁進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔；
6、開始注射，如果正確注射至視網(wǎng)膜下腔，能感受到適度的阻力；緩慢出針，可將針頭固定15s，避免注射病毒回流到切口位置；
7、使用彎曲的敷料鉗輕輕地將眼睛推回眼眶；將適量0.25%布比卡因，滴在注射部位；
8、小鼠蘇醒后置于加熱墊上，整個注射過程控制在5min內(nèi)完成；
9、小鼠恢復(fù)活動能力后放回鼠籠。
『病毒包裝-AAV感染眼睛』- 玻璃體腔注射
玻璃體腔注射（IVT）是將藥物直接注入眼球玻璃體腔內(nèi)，侵襲性較小、術(shù)后并發(fā)癥較少，但由于內(nèi)界膜ILM的存在，大多數(shù)AAV血清型無法傳遞至RGCs之外的細(xì)胞內(nèi)。
玻璃體腔注射較適用于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)或Müller神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的靶向。此種注射方法會產(chǎn)生針對AAV衣殼蛋白的體液免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)可阻礙再次注射時AAV的表達(dá)，如果兩只眼都需要連續(xù)治療的話，需要避免使用這種注射方式。
小鼠玻璃體腔注射步驟：
1、麻醉：4.3%水合氯醛 0.01ml/g ；
2、散瞳：建議雙眼散瞳，以防一眼出現(xiàn)意外時可以迅速換眼；
3、甲基纖維素保持眼表濕潤；
4、抗生素眼藥水、表麻藥術(shù)前滴眼；
5、調(diào)整小鼠頭位，讓小鼠眼球保持角膜緣水平位；
6、注射位置：理論上是角膜緣后1mm，也有選擇在顳側(cè)進(jìn)行，注意避開血管。白鼠還可以看見視網(wǎng)膜血管，需避開；
7、注射切口：推薦使用ALCON的10-0針做切口，非常整齊，33G的針進(jìn)去水密非常好。也可以用破囊針。切口越整齊，跟針越匹配，越不易滲漏；
8、注射進(jìn)針：針尖垂直進(jìn)入，隨后傾斜。這一步非常關(guān)鍵，小鼠眼球小，晶體球形，傾斜角度小了會損傷晶體，大了會扎上視網(wǎng)膜，出血；
9、注射：緩慢推注，無阻力。迅速推注的話取材時會發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜散在出血點(diǎn)，可能干擾試驗(yàn)結(jié)果。推針以后留針0.5-1min，迅速出針。
『病毒包裝-AAV感染神經(jīng)系統(tǒng)』- 腦立體定位注射
腦定位注射，相比其他注射方式靶向性強(qiáng)，注射病毒體積小，但是侵入性也強(qiáng)，且對操作者具有很高的要求。在立體定位手術(shù)時，顱骨上常用的注射參照點(diǎn)是前囪，也就是中矢狀冠狀縫的交叉點(diǎn)。具體的注射部位，可依據(jù)研究的需要而確定。
注射步驟：
1、安裝定位儀：在生物安全柜中安裝立體定位框架和工具。
2、準(zhǔn)備并吸取病毒懸液：在噴嘴出安裝超微量注射器，把針尖浸在準(zhǔn)備好的AAV病毒懸液中，并使用“快速反向”功能吸取。
3、排除空氣：使用“快速正向”功能檢查泡沫，直到在針頭處出現(xiàn)一滴液體。用浸泡在0.1M NaOH溶液中的棉花輕輕拭去針尖的液滴。
4、麻醉大鼠：選取250g左右的大鼠，通過25G 1毫升注射器注射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）。
5、固定大鼠：首先將大鼠的下切牙固定在齒棒上，然后用耳棒通過大鼠的外耳道進(jìn)行固定，并固定頭部。檢查顱骨是否是水平的，并確保兩個眼睛在同一水平線上。在每只眼睛中滴入一滴聚丙烯酸，以防麻醉造成眼睛干燥。調(diào)整光源對準(zhǔn)大鼠的頭部，剃去頭部的毛并用酒精消毒清潔。
6、切口并暴露前囪點(diǎn)：用刀片在頭皮上前后軸切口，并用鉗子保持刀口開放狀態(tài)，用棉球吸去血。去除骨膜以便看到前囪。
7、暴露λ點(diǎn)：調(diào)整齒夾的垂直位置，使得前囪點(diǎn)和λ點(diǎn)的高度一致，如果λ點(diǎn)的位置難以看到，讓切口處干燥5-10min后再尋找。
8、確定前囪點(diǎn)的AP和ML坐標(biāo)和目標(biāo)注射點(diǎn)的距離：將針垂直于前囪點(diǎn)，并記錄AP和ML坐標(biāo)的數(shù)值。參考大鼠腦圖譜的標(biāo)記的目標(biāo)注射部位的AP和ML值，計(jì)算前囪點(diǎn)與目標(biāo)注射部位的AP和ML坐標(biāo)，并做標(biāo)記。
9、確定前囪點(diǎn)的DV坐標(biāo)和目標(biāo)注射點(diǎn)的距離：用鉆頭在顱骨上打洞，注意不要損傷硬腦膜。把針尖置于硬腦膜的表面并測量出前囪點(diǎn)DV的坐標(biāo)。計(jì)算目標(biāo)注射部位的DV坐標(biāo)。
10、注射AAV：緩慢垂直移動注射器針尖到達(dá)目標(biāo)注射部位，慢慢地將針插入并靜置5min。然后，以0.2 μl/min的速度，將2μL的病毒懸液注射入腦。結(jié)束后，需要靜置5min再將注射器緩慢移出。
11、縫合并做標(biāo)記：縫合頭皮，并做耳標(biāo)。
12、大鼠術(shù)后的護(hù)理：將大鼠單獨(dú)放在一個干凈的籠子里，直到醒來。第一天需要讓大鼠在獨(dú)立的通風(fēng)籠中度過。
13、處理針頭和手術(shù)材料：先用0.1 M NaOH 或10%氯漂白劑清洗手術(shù)工具，并用蒸餾水沖洗，最后用酒精沖洗。
圖1. 小鼠頭部被安裝在立體定位儀上
（ZMD et al. Springer New York, 2014）
『病毒包裝-AAV感染神經(jīng)系統(tǒng)』- 鞘內(nèi)注射
與系統(tǒng)注射和實(shí)質(zhì)內(nèi)注射相比，鞘內(nèi)給藥是一種具有較低劑量要求的微創(chuàng)替代方法。
注射步驟：
1、使用毛巾覆蓋在小鼠頭部和背部，露出髂嵴以下的腰部區(qū)域；用非慣用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髖骨)，手的頂部輕輕放在小鼠身體和頭部上，使其保持平靜。
注：在髂骨上的握力應(yīng)該足夠強(qiáng)，以固定小鼠的腿部活動，并使腿部向外和向下伸展。
2、使用慣用手食指從腰椎到骶部沿脊柱輕輕按壓，同時使用非慣用手輕輕上拉小鼠，以打開椎節(jié)之間的空間，方便進(jìn)針。
3、將1 ?”號針的斜面指向小鼠頭部，然后將針以70°角插入脊柱中線的腰椎處，當(dāng)感覺針碰到骨頭時，將針的角度調(diào)整到30°夾角，并將針插入椎節(jié)之間。
注：需多次嘗試找到合適的進(jìn)入點(diǎn)，針頭進(jìn)入脊柱后推針沒有阻力，尾巴或后腿的反射性彈跳出現(xiàn)時，說明已正確入針。
4、輕輕壓下注射器的活塞，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛網(wǎng)膜下腔。
注：注射時間控制在10-30s較好，速度太快會導(dǎo)致小鼠后腿抽筋，該現(xiàn)象會在60s內(nèi)消失。
5、注射后，將針180°旋轉(zhuǎn)1-2次，然后將針從脊柱中取出。
6、小鼠放回籠子觀察，確認(rèn)恢復(fù)正常運(yùn)動功能。
注：此法適用于成年小鼠或大鼠。
『AAV注射專題』之腸道-灌腸
腸組織常見的注射方式有尾靜脈注射、腹腔注射、口服、灌腸和腸系膜上動脈（SMA）注射等。其中尾靜脈注射和腹腔注射作為系統(tǒng)性給藥方式，雖然操作簡單，損傷性小，但是注射量較大，特異性不強(qiáng)。口服和灌腸，都屬于腔內(nèi)給藥，主要是黏膜的轉(zhuǎn)導(dǎo)，由于胃酸及腸蛋白水解酶等的中和作用，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并不高，但操作簡單。
灌腸的操作步驟：
（1）小鼠禁食過夜，并預(yù)先用NAC和毛果蕓香堿處理以促進(jìn)腸道隱窩黏液排出。
（2）使用異氟醚將小鼠麻醉。
（3）在不使用鎮(zhèn)靜劑的狀態(tài)下，用1英寸不銹鋼的直圓針頭直腸注射300ul 20mM的NAC清洗結(jié)腸30min。
（4）再次麻醉小鼠，通過灌腸給予小鼠5*10E10vg，600uL體積量的AAV。
注：可通過直腸注射亞甲基藍(lán)觀察液體到達(dá)盲腸的預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定合適的灌腸液體積。
『AAV注射專題』之腸道-腸系膜動脈注射
腸系膜動脈（SMA）注射效果較好，但對實(shí)驗(yàn)條件和操作手法要求較高，對小鼠傷害性也較大。
腸系膜動脈(SMA)注射操作步驟：
（1）將小鼠以右側(cè)臥位固定在手術(shù)板上，保持四肢松弛，放入含2-4.5% O2的異氟醚誘導(dǎo)室進(jìn)行麻醉。小鼠深度麻醉后，將其放在手術(shù)臺上，對小鼠手術(shù)區(qū)域做去毛及消毒處理。
注：為保持小鼠體溫，可在手術(shù)板下放置加熱墊。整個手術(shù)過程在手術(shù)顯微鏡下放大5-40倍進(jìn)行操作。
（2）手術(shù)開始前，皮下注射丁丙諾啡進(jìn)行手術(shù)鎮(zhèn)痛；沿左腋線最后一個肋間隙和肋下區(qū)域注射布比卡因進(jìn)行局部鎮(zhèn)痛。
（3）沿著腋線和側(cè)腹，在脾臟區(qū)域的左側(cè)皮膚上開一個1-2 cm的切口，切開腹外斜肌，使用微型牽引器將皮膚和腹壁固定，并用溫鹽水紗布覆蓋小腸防止縮回，暴露SMA。
（4）在放大20倍的情況下，將SMA輕輕地從腹膜后剝離，在SMA的近端接頭周圍放置一個小的穩(wěn)定接頭連接注射針，使用微血管夾暫時切斷腹主動脈的血液供應(yīng)。
（5）將定制33號1/2”針頭連接到250μl漢密爾頓TLL氣密性進(jìn)樣針注射器上，輕輕插入SMA進(jìn)行病毒注射（1*10E11vg, 200μL體積的AAV8）。將固定帶輕扎血管，防止注射部位泄漏。
注：注射過程中使用顯微鏡觀察以確保注射可視準(zhǔn)確。
（6）注射后立即取下針頭，縫合注射部位。取下固定帶和微血管夾，使血液回流至小腸。使用無菌棉簽輕輕按壓注射部位進(jìn)行止血。
（7）在腹腔內(nèi)注射1ml無菌溫鹽水后，對小鼠進(jìn)行縫合。
（8）術(shù)后每15min對小鼠進(jìn)行一次監(jiān)測，直到小鼠能夠腹臥。每2小時對動物進(jìn)行一次監(jiān)測，直至放回籠中。
圖1 小鼠SMA注射過程中顯微手術(shù)步驟的代表性照片
(Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Microsurgery, 2010.)
