siRNA與shRNA

RNA干擾是一種能特異性、選擇性破壞靶基因表達(dá)的過程。介導(dǎo)RNA干擾效應(yīng)的方法包括化學(xué)合成的雙鏈小干擾RNA（siRNA）、基于載體的短發(fā)夾RNA（shRNA）等。雖然siRNA和shRNA可以實(shí)現(xiàn)相似的功能結(jié)果，但本質(zhì)上是不同的分子，一起來了解一下吧~

siRNA

siRNA是一種小的雙鏈RNA分子（~21-25 nt），由Dicer酶（RNAaseⅢ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。siRNA是RISC的主要成員，激發(fā)與之互補(bǔ)的目標(biāo)mRNA的沉默。

siRNA的結(jié)構(gòu)示意圖

具有如下特點(diǎn)∶1.生成需要Argonaute家族蛋白存在。2.siRNA一般是人工體外合成的，通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入人體內(nèi)，是RNA干涉的中間產(chǎn)物；植物體內(nèi)也存在內(nèi)源的siRNA。3. 結(jié)構(gòu)上，siRNA是雙鏈RNA。4.在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并與mRNA完全互補(bǔ)。5.在作用方式上，siRNA只能導(dǎo)致靶標(biāo)基因的降解，即為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

siRNA介導(dǎo)的RNA干擾通路

在哺乳動物中，Dicer酶與雙鏈Tat - RNA結(jié)合蛋白(TRBP)或PACT (PKR激活蛋白)相互作用，介導(dǎo)RNA干擾和miRNA處理。TRBP和PACT在結(jié)構(gòu)上相關(guān)，但對RNA依賴性蛋白激酶(PKR)發(fā)揮相反的調(diào)節(jié)作用。

siRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，或是直接裝載到RISC上，或是進(jìn)入Dicer酶介導(dǎo)的干擾過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA 3’端12 nt的位置切割mRNA。

化學(xué)合成的siRNA具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高、對細(xì)胞或組織的毒副作用小、可大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)，特別適用于基因靶位點(diǎn)不確定情況下，進(jìn)行siRNA有效片段的篩選。

shRNA

shRNA是可以克隆至表達(dá)載體并表達(dá)雙鏈siRNA的RNA分子，包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)序列分隔，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polⅢ啟動子控制。相對于siRNA，shRNA在細(xì)胞核中合成，進(jìn)一步加工并運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，然后進(jìn)入RISC發(fā)揮活性。miRNA的合成與成熟研究為shRNA的合成，特別是基于miR-30的shRNA的合成提供了基礎(chǔ)。

shRNA的結(jié)構(gòu)示意圖

shRNA介導(dǎo)的RNA干擾通路

shRNA表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，需要轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。初級轉(zhuǎn)錄本（Pri-shRNA）由Drosha/DGCR8復(fù)合物處理形成pre-shRNA。Pre-shRNA被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，裝載到Dicer/TRBP/PACT復(fù)合物上，隨后被進(jìn)一步加工成成熟的shRNA。成熟shRNA與含有RISC的Argonaute蛋白相關(guān)，介導(dǎo)mRNA的切割和降解或處理小體（P-bodies）的翻譯抑制，行使RNA干擾功能。

shRNA 表達(dá)載體：

①shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄生成shRNA，利用細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶，生成相應(yīng)的siRNA，發(fā)揮RNAi作用。

②shRNA病毒表達(dá)載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等，機(jī)制與質(zhì)粒載體相似，但轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率比較高。

siRNA和shRNA的區(qū)別