你知道幾種動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用方法？

將基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的方法有多種，效率也不盡相同，可根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用。 這里介紹幾種常用的方法：

1. 磷酸鈣沉淀法

該轉(zhuǎn)化方法是動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化中經(jīng)典而又簡單的方法。具體做法大致是∶將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，形成磷酸鈣微結(jié)晶與DNA的共沉淀物，滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4~16 h，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便可以進(jìn)入受體細(xì)胞細(xì)胞核，并整合到宿主染色體上；棄去 DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA，可以提高轉(zhuǎn)化效率。這種方法多數(shù)用于單層培養(yǎng)的細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。

磷酸鈣沉淀法具有操作簡便、成本低廉、可大批量轉(zhuǎn)染、對(duì)細(xì)胞毒性較小、效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。但其轉(zhuǎn)染效率較低，對(duì)較長（>20kb）的DNA片段效果更差，應(yīng)用甘油或DMSO對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行休克，轉(zhuǎn)染效率會(huì)得到一定程度提高。

2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)感染法

這種方法即用脂質(zhì)體包埋核酸分子，然后將其導(dǎo)入細(xì)胞。脂質(zhì)體是一種人工構(gòu)建的磷脂雙分子層膜，用于轉(zhuǎn)移DNA較理想的膜成分是帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸。利用該方法曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。

脂質(zhì)體介導(dǎo)法的優(yōu)點(diǎn)是效果穩(wěn)定、感染效率高（比磷酸鈣沉淀法高5~100倍）；其缺點(diǎn)是成本較高、對(duì)外源基因長度有一定限制、細(xì)胞內(nèi)積累的脂類對(duì)細(xì)胞有一定的毒性。

3. 顯微注射法

顯微注射法是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑。其技術(shù)關(guān)鍵如下：①外源基因的制備；②收集受精卵；③顯微注射；④受精卵移植。

顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)是：①此法可向任何類型細(xì)胞導(dǎo)入外源基因，甚至可向受精卵或早期胚胎中導(dǎo)入外源基因；②DNA用量極少，每個(gè)細(xì)胞僅需10-11 ml的注射體積；③注入細(xì)胞的DNA分子數(shù)可加以控制；④外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體組中的效率可達(dá)50%～100%，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系的比例也可達(dá)20%。此法的缺點(diǎn)是其設(shè)備要求離，且很昂貴。

4. 病毒感染法

通過病毒感染的方式將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，是一種常用的轉(zhuǎn)基因方法，例如現(xiàn)在常用的腺病毒、慢病毒和AAV等。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)。但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法感染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。

5. 電擊法

將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解于受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時(shí)高壓電場(chǎng)，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時(shí)DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。電擊法常用于對(duì)磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。

6.血影細(xì)胞介導(dǎo)法

血影細(xì)胞是指哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞在外部壓力環(huán)境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性大增，在血紅蛋白溢出的同時(shí)，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生細(xì)胞融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。