重組慢病毒的制備和使用
維真生物采用2代慢病毒包裝系統(tǒng)來制備慢病毒。該系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，包括1個(gè)包裝質(zhì)粒(psPAX2)、1 個(gè)包膜質(zhì)粒(pMD2G)、1個(gè)目的基因質(zhì)粒和1株包裝細(xì)胞(293T cell)。下圖是慢病毒制備流程示意圖：
1. 重組慢病毒的制備
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Day1:
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匯合度90%的10cm dishs HEK293T細(xì)胞（~ 6×107/dish）按1：1比例傳代至15cm dishs，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)到90%-95%（~ 1.5×108/dish），培養(yǎng)基為Gibico高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）。
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Day2:
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1)轉(zhuǎn)染前2-3個(gè)小時(shí)更換培養(yǎng)基（含10%FBS)；
2)按照以下比例配制轉(zhuǎn)染試劑：
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Mix 1
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體積μl
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Mix 2
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量
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DMEM（無FBS）
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1000μl
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DMEM（無FBS）
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1000μl
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目的基因質(zhì)粒
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25μg
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VGF
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190μl（1μg/μl）
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PMD2G
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7.5μg
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PSPAX2
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15μg
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Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫30min，加入至15cm dish中。（細(xì)胞達(dá)到匯合度90%，細(xì)胞過少會影響轉(zhuǎn)染效率）
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Day3:
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6h-24h內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基（含10%FBS），觀察轉(zhuǎn)染效率并拍照。
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Day5:
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72h觀察細(xì)胞狀態(tài)并拍照。收取上清培養(yǎng)基，過0.45μm濾膜，上清培養(yǎng)基加入超速離心管中，配平后離心，25000rpm，4℃離心1.5h。棄上清，用適當(dāng)病毒保存液回溶混勻溶解過夜。
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Day6：
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收集病毒分裝，進(jìn)行病毒滴度測定。
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2. 重組慢病毒滴度測定
2.1 整合數(shù)法標(biāo)定不帶熒光的重組慢病毒滴度
2.1.1 病毒感染細(xì)胞
①感染前6 h 在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中以2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔 均勻接種HEK293細(xì)胞。
②將慢病毒進(jìn)行梯度稀釋，共做3個(gè)梯度，即每孔（500μl 無雙抗、無血清的DMEM培養(yǎng)基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒，振蕩混勻后加至接種好細(xì)胞的24孔板中，加病毒之前將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸凈。
③感染 18-20h 后，將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基。
④感染 64-68h 后收集細(xì)胞并進(jìn)行基因組DNA的提取。
⑤測定時(shí)，設(shè)置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對照，以校驗(yàn)檢測出的數(shù)值。
2.1.2 提取基因組DNA（按照AxyGEN 的基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作）
2.1.3 qPCR檢測
① 以被測慢病毒載體梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，慢病毒載體上的通用引物進(jìn)行qPCR以獲得病毒整合拷貝數(shù)。
② 以Actin質(zhì)粒梯度稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品，Actin引物進(jìn)行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數(shù)以得到基因組拷貝數(shù)。
③ qPCR
qPCR反應(yīng)體系如下：
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組成成分
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體積
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2 × SYBR Green mix
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10 μl
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Primers (Forward & Reverse mixture)
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0.8 μl
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超純水（DNase & RNase Free）
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7.2μl
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模板
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2μl
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Total
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20μl
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qPCR反應(yīng)程序：
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循環(huán)參數(shù)
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預(yù)變性95℃
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3min
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95℃
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5S
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60℃
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15S
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72℃
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15S+Plate Read
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39個(gè)循環(huán)
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2.1.4 計(jì)算慢病毒IU（Integration Unit）ml-1
IU ml-1=(C×N×D×1000)/V
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注：
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C=平均每基因組慢病毒整合拷貝數(shù)
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D=病毒的稀釋倍數(shù)
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N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目（約為2.5×105）
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V=加入稀釋病毒的體積數(shù)
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2.2 孔稀釋法標(biāo)定帶熒光的重組慢病毒滴度
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Day1:
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細(xì)胞的準(zhǔn)備
在96孔板中的每個(gè)孔中接種1-4×104個(gè) HEK293細(xì)胞。
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Day2:
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病毒的稀釋與感染
在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋，分別是1~10-6梯度。棄去96孔板中原有的培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，注意是兩個(gè)重復(fù)，并做好標(biāo)記。
實(shí)驗(yàn)預(yù)覽如圖：
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1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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A
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100
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10-1
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10-2
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10-3
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10-4
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10-5
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10-6
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B
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100
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10-1
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10-2
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10-3
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10-4
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10-5
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10-6
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Day5:
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熒光計(jì)數(shù)與滴度計(jì)算
感染72h后，用熒光顯微鏡對熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。數(shù)出最后兩孔的熒光細(xì)胞數(shù)，計(jì)算2個(gè)重復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計(jì)算出平均數(shù)，假設(shè)為A（倒數(shù)第二孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）和B（倒數(shù)第一孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）。
慢病毒滴度計(jì)算公式： 病毒滴度 (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μl）
下面是GFP慢病毒的滴度檢測結(jié)果：
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熒光照片
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熒光照片
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10-5μl
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10-6μl
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結(jié)果
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病毒名稱
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滴度
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體積
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GFP慢病毒
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3.5×10E8TU/ml
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200μl×1
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3. 慢病毒的使用
3.1 重組慢病毒體外感染細(xì)胞
不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議在正式實(shí)驗(yàn)前，在目的細(xì)胞中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳MOI值。
3.1.1 慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)
為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。操作步驟如下：
①第一天 細(xì)胞的準(zhǔn)備
將目的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長良好，請保證細(xì)胞貼壁過夜。
②第二天 病毒的稀釋
取10μL慢病毒原液加入90μL培養(yǎng)液中做1:10稀釋（10-1），以此為起點(diǎn)做梯度稀釋直至稀釋10-7?？筛鶕?jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。
③第二天 感染目的細(xì)胞
取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對照組。
④第二至十天 觀察熒光或檢測
慢病毒對細(xì)胞的感染較慢，請?jiān)诟腥炯?xì)胞后48、72、96、120小時(shí)分別觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況（如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽，請?jiān)?8、72、96、120小時(shí)分別收獲細(xì)胞并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達(dá)）。
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注意：
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由于不同細(xì)胞對慢病毒感染過程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，請于12-24小時(shí)后觀察細(xì)胞狀態(tài)以確認(rèn)加入的病毒量是否合適。
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3.1.2 慢病毒感染目的細(xì)胞
進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)可使用完全培養(yǎng)液（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋。培養(yǎng)液中的血清、雙抗或其他營養(yǎng)因子不會影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行HEK293細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：
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注意：
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實(shí)驗(yàn)前請按照不同的MOI 設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI 和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量。
最適病毒用量的計(jì)算公式：
病毒用量TU=最佳MOI×細(xì)胞數(shù)目/病毒滴度
例如, 如果您目的細(xì)胞的最佳MOI=10，您需要感染106的細(xì)胞，那么您共計(jì)需要107 TU的病毒. 如果病毒滴度為1×108 TU/mL, 那么您實(shí)驗(yàn)需要的病毒量就是100μL.
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① 第一天 細(xì)胞的準(zhǔn)備
在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個(gè)孔內(nèi)接種3-5×104個(gè)HEK 293細(xì)胞，鋪板時(shí)細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)液體積為300μL，進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的匯合度約為70%。
②第二天 病毒的準(zhǔn)備
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況和MOI 值，用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋慢病毒原液。
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注意：
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可使用PBS緩沖液或無血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。
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③第二天 感染目的細(xì)胞
在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液， 混勻后放于CO2培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）孵育過夜。
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注意：
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1）感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，請務(wù)必保證加入病毒前，細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。
2）若慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，可通過提高M(jìn)OI 值提高病毒的感染效率，也可在培養(yǎng)液中加入維真生物助感染試劑ADV-HR來提高病毒的感染效率。
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④第三天 更換培養(yǎng)液
病毒感染細(xì)胞24小時(shí)后，更換培養(yǎng)液。
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注意：
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換液具體時(shí)間需視細(xì)胞狀態(tài)而定。如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用，影響細(xì)胞生長狀態(tài)，最短可于加病毒4小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。
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⑤第六天 感染效率檢測
在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計(jì)算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如選擇的慢病毒載體不帶有熒光標(biāo)記，可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達(dá)來評估感染效率。
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注意：
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1）慢病毒表達(dá)較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長，建議感染96小時(shí)后觀察熒光的表達(dá)。
2）感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光表達(dá)的時(shí)間和強(qiáng)度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。
3）感染期間，請根據(jù)細(xì)胞生長的情況及時(shí)換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。
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耗材名稱
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貨號
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品牌
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細(xì)胞培養(yǎng)板 10cm
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704001
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NEST
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細(xì)胞培養(yǎng)板 15cm
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715001
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NEST
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10ml血清移液管
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4488
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Corning
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50ml血清移液管
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4490
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Corning
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100-1250無菌加長帶刻度濾芯槍頭
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TF112-1000-Q
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QSP
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細(xì)胞凍存管
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377267
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Corning
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DMEM高糖培養(yǎng)基
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C11965500BT
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GIBICO
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HEPES溶液 1M
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SH30237.01
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HyClone
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青霉素-鏈霉素溶液（100*）
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C0222
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碧云天
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胎牛血清
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1122050
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Gibico
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0.25%胰蛋白酶
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SH30042.01
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Hyclone
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10xPBS
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ST476
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碧云天
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DMSO
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D8372
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SOLARBIO
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儀器名稱
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規(guī)格型號
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品牌
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生物安全柜
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BSC-1300IIA2
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蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司
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倒置顯微鏡
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CKX31SF
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OLYMPUS
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實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增儀（QPCR儀）
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CFX96
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BIO-RAD
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熒光顯微鏡
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ELWD0.3
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Nikon
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超低溫保存箱
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DW-86L386
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青島海爾特種儀器有限公司
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臺式高速冷凍離心機(jī)
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1580R
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LAB GENE 基因有限公司
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