最近中文字幕完整版视频_日韩欧美午夜电影_亚洲高清无码第一_亚洲中文字幕码在线电影不卡_精品久久免费电影_国产女人喷水视频_苍井空在线a∨免费观看_欧美三级性爱_国产亚洲精品成人AA片在线播放_人妻无码日韩精品超级黄

重組腺相關(guān)病毒的制備

維真生物腺相關(guān)病毒包裝采用的是經(jīng)典的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法（Helper-free AAV包裝系統(tǒng)，即AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)），該系統(tǒng)包括3個(gè)載體和1株包裝細(xì)胞：3個(gè)載體【載體質(zhì)粒（含有目的基因表達(dá)盒，其兩端是AAV2的反向末端重復(fù)序列）、包裝質(zhì)粒（反式提供具有AAV復(fù)制和包裝功能的蛋白R(shí)ep和Cap）和輔助質(zhì)粒（含有輔助病毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a、E4等）】和1株包裝細(xì)胞（HEK293T cell）。腺相關(guān)病毒包裝的具體示意圖如下：

1. 腺相關(guān)病毒重組載體構(gòu)建

1) 根據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮褪茉嚰?xì)胞選擇不同的載體，在此以人源ORF為例。

2) 維真生物公司AAV載體的MCS區(qū)與人源ORF cDNA克隆現(xiàn)貨庫(kù)中的MCS區(qū)相兼容，可以通過(guò)簡(jiǎn)單酶切-連接-轉(zhuǎn)化的方式將目的基因亞克隆至目標(biāo)AAV表達(dá)載體，得到陽(yáng)性克隆后通過(guò)測(cè)序以確認(rèn)插入片段的正確性。

2. 細(xì)胞凍存

1) 按照細(xì)胞培養(yǎng)流程，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞吹下來(lái)加入50mL離心管中，200g離心5min。

2) 配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

3) 離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細(xì)胞吹勻。

4) 取上述溶液每1mL分至1.5mL 細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記和日期。

5) 將凍存管放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80℃冰箱過(guò)夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室溫，使異丙醇的溫度達(dá)到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）；

6) 第二天將凍存盒放入液氮或 -150℃冰箱中以長(zhǎng)期保存；同時(shí)取一支細(xì)胞做復(fù)蘇檢測(cè)，以判斷該批細(xì)胞的凍存質(zhì)量。

3. 細(xì)胞復(fù)蘇

1) 10cm dish中加10ml新鮮DMEM培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱預(yù)熱至37℃。

2) 從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分鐘左右）。

3) 待細(xì)胞凍存管中溶液融化后，200g離心5min，棄掉液體并吸取1ml預(yù)熱的培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀輕輕吹起，轉(zhuǎn)移到10cm dish中。

4) 搖晃均勻，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5) 培養(yǎng)過(guò)夜，更換新鮮培養(yǎng)基（除去凍存液中DMSO對(duì)細(xì)胞的毒害作用）。

4. 細(xì)胞傳代（以10cm dish為例）

1) 生物安全柜紫外滅菌半小時(shí)。

2) 滅菌期間，將DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素混合液)和PBS置于37℃水浴鍋中預(yù)熱；0.25% 胰酶放置室溫，不可水浴加熱。

3) 取匯合度接近100%且活性較好的HEK293T 細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)盤(pán)中培養(yǎng)基，加入約5mL，1×PBS，搖晃幾下，吸棄PBS。

4) 加1mL 0.25% 胰酶在生物安全柜內(nèi)消化約1min，室溫低時(shí)可放置于培養(yǎng)箱中消化。消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則影響細(xì)胞再次貼壁效率和活性。

5) 加入約5mL預(yù)熱的培養(yǎng)基，終止消化。

6) 用移液管吹打均勻（吹打過(guò)程中不可用力過(guò)大，否則會(huì)吹破細(xì)胞），按照1:3的比例傳代。各取2mL培養(yǎng)基至新的10cm dish中，再加入 8mL預(yù)熱的DMEM 培養(yǎng)基。

5. AAV病毒包裝（以10cm dish為例）

Day1：匯合度90%以上的HEK293T細(xì)胞按1：3比例傳盤(pán)（每盤(pán)大約2.5× 106），培養(yǎng)基為Hyclone高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）。

Day2：轉(zhuǎn)染前1-2h左右，換成無(wú)血清培養(yǎng)基。

按照以下比例配制轉(zhuǎn)染試劑：

Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫15-30min，逐滴加入至10cm dish中。（此時(shí)細(xì)胞匯合度在80%-90%比較適宜，細(xì)胞過(guò)少會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率）

Day3：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后，換新的無(wú)血清培養(yǎng)基。

Day5：轉(zhuǎn)染72h收毒，將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基一起收集至50ml離心管中，離心，分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀：PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒；裂解細(xì)胞沉淀收毒；合并從細(xì)胞沉淀和上清中得到的AAV。

6. AAV 病毒純化與濃縮

6.1 純化——碘克沙醇密度梯度離心。

① 配制不同濃度的碘克沙醇；

② 取一個(gè)超離管，用電動(dòng)移液器逐層、緩慢加入不同濃度的碘克沙醇；

③ 將處理好的病毒液加入到最上層；

④ 配平后超速，18℃、48000rpm、2.5h離心。

6.2 濃縮

① 離心完畢后，將超濾管底用針頭刺破，收集腺相關(guān)病毒所在層至15mL管中；

② 將收集的病毒液注入濃縮柱中，加PBS+0.001%PF68至滿，混勻；

③ 4000rpm，10℃，離心約1h。

④ 將超濾管中剩下的液體反復(fù)吹打后吸至病毒儲(chǔ)存管中，最后加入病毒儲(chǔ)存液，標(biāo)明名稱和日期。

⑤ 將收集起來(lái)的病毒渦旋震蕩混勻后離心，吸 10μL 病毒液進(jìn)行滴度檢測(cè)。

7. 病毒滴度檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)定量PCR法是一種簡(jiǎn)單的、高通量的測(cè)定純化病毒樣本中腺相關(guān)病毒顆粒數(shù)量的方法。每個(gè)模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。

7.1 去除游離DNA分子

先將病毒稀釋10倍，以保證樣品中游離的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS緩沖液中，充分混勻。按以下體系配制Mixture：

37 ℃ 孵育 30 min，95℃加熱 5min 使 DNA 酶失活。

7.2 去除病毒蛋白外殼

向上述體系中再加入 1μl 蛋白酶 K（5μg/μl）。37 ℃ 孵育 30 min；再加30ul超純水稀釋至40ul（至此病毒原液稀釋100倍），95℃加熱 5 min使蛋白酶 K 失活，然后 12000rpm，離心 2min，取上清進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)。

37 ℃ 孵育 30 min，95℃加熱 5min 使 DNA 酶失活。

7.3 qPCR

將步驟2得到的上清，取 5μl 進(jìn)行 10 倍梯度稀釋，即病毒原液稀釋了 1000 倍。分別取 2μl 待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)。

qPCR反應(yīng)體系如下：

qPCR反應(yīng)程序：

7.4 數(shù)據(jù)分析

病毒顆粒數(shù)的計(jì)算：病毒顆粒數(shù)(VP/mL) = 與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)值×1000

基因過(guò)表達(dá)

基因沉默

基因編輯