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腺病毒包裝服務(wù)
腺病毒(Adenovirus,Ad)是一種無包膜的DNA病毒,其復(fù)制不依賴于宿主細胞的分裂。腺病毒擁有近50個血清型,大多數(shù)腺病毒載體都是基于血清型2和血清型5,通過轉(zhuǎn)基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的復(fù)制能力。這些重組病毒僅在高水平表達E1基因的細胞中復(fù)制,因此是一種適用于治療的高效控制系統(tǒng)。重組腺病毒是進行基因轉(zhuǎn)移和表達的工具,功能強大并易于操作。腺病毒獨特的生物學(xué)特征使它成為“載體的首選”,被科研工作者廣泛使用。
維真生物成立之初,其研發(fā)團隊就建成了涵蓋12000多種人源基因的腺病毒庫,具體信息見人源ORF腺病毒。產(chǎn)品自2013年面市后,公司也定制了很多腺病毒包裝項目。因此,維真生物擁有豐富的腺病毒包裝經(jīng)驗,可為客戶提供體內(nèi)外實驗所需的各種規(guī)格腺病毒,以滿足客戶多樣化的實驗需求。下面是具體服務(wù)內(nèi)容(目錄價僅為病毒包裝費用):
服務(wù)編號 | 服務(wù)類型 | 規(guī)格 | 目錄價 | 貨期 |
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WZ050001 | 小包裝、非純化 | 滴度=1×10E10-11 vp/ml;體積1ml | 詢價 | 3-4周 |
WZ050002 | 中包裝、純化 | 滴度≥1×10E10 pfu/ml;體積1ml | 詢價 | 4-5周 |
WZ050003 | 大包裝、純化 | 滴度≥1×10E11 pfu/ml;體積1ml | 詢價 | 4-5周 |
*如您對上述服務(wù)感興趣,請您點擊“歡迎垂詢”留下您的信息,我們將為您提供具體實驗方案和項目價格。
相關(guān)服務(wù): 克隆服務(wù) 基因表達分析服務(wù)
↓↓ 分以下幾個部分做詳細介紹 ↓↓ |
腺病毒(AdV)結(jié)構(gòu)
腺病毒是一種直徑為90-100nm的病毒顆粒,衣殼呈廿面體,由240個六鄰體和12個五鄰體組成。以五鄰體蛋白為基底由衣殼表面伸出12根纖毛,纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)。五鄰體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細胞表面的受體結(jié)合,在病毒感染細胞過程中起著非常重要的作用。右面是腺病毒的結(jié)構(gòu)示意圖: |
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腺病毒是一種雙鏈線性的DNA病毒,其基因組長度約為36kb。基因組兩端各有一個103 bp的反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat, ITR),參與病毒DNA的復(fù)制;ITR的內(nèi)側(cè)為病毒包裝信號Ψ,參與腺病毒基因組的衣殼化?;蚪M包含早期表達的與腺病毒復(fù)制相關(guān)的E1~E4基因和晚期表達的與腺病毒顆粒組裝相關(guān)的L1~L5基因。下圖是人類血清5型腺病毒基因組的示意圖:
基于人血清5型腺病毒的基因組結(jié)構(gòu),結(jié)合各基因的功能,科學(xué)家們開發(fā)了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒載體。E1基因在組裝感染性病毒顆粒時必不可少,但是可以在HEK293包裝細胞中得到補充,而E3基因不影病毒的包裝。由于E1和E3基因的缺失,腺病毒載體可插入高達7.5kb的外源基因。
腺病毒感染細胞的第一步是通過纖突蛋白與細胞表面CAR結(jié)合。腺病毒粘附后,五鄰體蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸(RGD)與細胞表面的整合素αvβ3和αvβ5結(jié)合并相互作用使腺病毒進入細胞。下圖是腺病毒感染細胞的示意圖:
![]() |
1、腺病毒感染的宿主細胞范圍廣,包括分裂細胞和不分裂細胞(某些抗腺病毒感染的淋巴瘤細胞除外)。
2、腺病毒感染效率高,在最佳感染條件下,感染率可達100%。
3、腺病毒的病毒滴度可以很高,純化、濃縮后可達1012-13vp/ml(即1010-11pfu/ml)。
4、腺病毒易于擴增,而其他病毒比如慢病毒和腺相關(guān)病毒需要重新包裝。
5、不整合到染色體中,無插入致突變性。
6、腺病毒理化性質(zhì)穩(wěn)定,4℃:數(shù)周。-80 ℃:數(shù)年。
Ad5腺病毒的高效感染依賴于靶細胞膜上的CAR和αvβ整合素,但是一些免疫細胞的細胞膜上卻缺乏這些受體,如造血干細胞。這就使得研究人員尋找新的腺病毒血清型,最終發(fā)現(xiàn)F35血清型對造血干細胞有很強的靶向性,因此,嵌合型Ad5/F35應(yīng)用而生。下面是Ad5 & Ad5/F35的結(jié)構(gòu)示意圖和區(qū)別:
![]() |
腺病毒種類 |
載體特點 |
功能 |
感染細胞受體 |
包裝系統(tǒng) |
AdV5 |
缺失E1和E3基因,允許插入長約8kb的外源基因 |
除免疫、血液類細胞外, |
CAR |
AdMax |
AdV5/F35 |
一個嵌合型腺病毒載體,主要結(jié)構(gòu)是在AdV5的基礎(chǔ)上,其受體結(jié)合位置的纖突(Fiber)改造成了F35型腺病毒(F35)的纖突(纖毛蛋白的Knob和shaft)。其細胞受體從AdV5的CAR變成了CD46,其他的基因仍舊保留AdV5載體的特性,能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)CAR表達不足的多種重要靶細胞,尤其是對腫瘤細胞及造型干細胞、間充質(zhì)干細胞等有較高的感染效率。
|
理論上感染所有有細胞核的細胞 |
CD46 |
AdMax |
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維真生物采用的包裝系統(tǒng)包括了AdEasy和AdMax系統(tǒng)。其中,AdMax系統(tǒng)操作簡便、重組效率高、獲得的病毒產(chǎn)率也高,故成為目前腺病毒包裝主要采用的系統(tǒng)。下圖是AdEasy和AdMax系統(tǒng)的示意圖:
|
AdEasy系統(tǒng) |
![]() |
AdMax系統(tǒng) |
維真生物可以提供從腺病毒(AdV)質(zhì)粒設(shè)計、構(gòu)建、包裝到表達分析的所有服務(wù)外包項目。而且,維真生物全套的腺病毒載體和表達系統(tǒng)可用于體內(nèi)和體外表達human/mouse/rat ORFs,lncRNA,circRNA,shRNAs和CRISPR/gRNA。維真生物生產(chǎn)的腺病毒具有滴度高、純度高和穩(wěn)定性高的三高優(yōu)點。下面是腺病毒從頭合成的流程:
維真生物采用碘克沙醇密度梯度超速離心法對AdV病毒進行純化。碘克沙醇是一種造影劑,已接受了臨床檢驗。它具有非離子型、對細胞無毒和代謝惰性等優(yōu)點?,F(xiàn)在在病毒純化方面應(yīng)用廣泛。它利用不同顆粒之間存在的沉降系數(shù)差,在一定離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶。下圖是AdV病毒純化后的示意圖:
維真生物的AdV病毒采用多種方法來定量,主要包括QPCR法、孔稀釋法和快速腺病毒滴度免疫檢測法。下表是各方法的詳情:
滴度標定法 |
原理 |
滴度單位 |
用途 |
QPCR法 |
用腺病毒基因組特異性引物進行QPCR。在定量曲線的線性范圍內(nèi),Ct值與已知拷貝數(shù)質(zhì)粒Ct值的比值,即為病毒基因組的初始拷貝數(shù) |
vp/ml |
預(yù)制腺病毒庫中 |
孔稀釋法 |
數(shù)熒光 |
pfu/ml |
帶熒光腺病毒的 |
免疫法 |
通過抗腺病毒抗體與感染了腺病毒供試樣品的細胞結(jié)合,再用辣根過氧化物酶標記的二抗與一抗結(jié)合,經(jīng)顯色液顯色,被感染的細胞顯示出明顯的棕色,通過計數(shù)及計算,測定腺病毒滴度 |
pfu/ml |
該方法不受熒光限制,適用于所有腺病毒滴度的測定 |
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1. 載體全: |
多種表達載體、多種標簽載體和多種報告基因可供客戶選擇。 |
2. 貨期短: |
Human ORF cDNA克隆可在2-3天穿梭至其他標簽(3×Flag,Myc,F(xiàn)lag,HA,6×His,F(xiàn)lag & His,GFP,RFP等)的穿梭載體,個性化定做腺病毒; |
3. 純度高: |
采用改良的碘克砂醇密度梯度超速離心法進行腺病毒純化,對于動物沒有任何毒性; |
4. 服務(wù)優(yōu): |
可根據(jù)客戶具體實驗,由公司專業(yè)技術(shù)人員提供載體構(gòu)建方案,提供特殊定制服務(wù)。 |
![]() |
1. 您好,我感染的細胞是滋養(yǎng)層細胞,感染之前在六孔板中接種十萬細胞,貼壁16h后加加入病毒(MOI=40),30h后細胞長滿。我想咨詢:病毒感染后實驗組跟對照組相比細胞生產(chǎn)差不多,正常嗎?
如果感染腺病毒的細胞狀態(tài)與未感染組的細胞狀態(tài)無明顯差異,說明該病毒對細胞沒有明顯毒性作用。因此,未必是病毒數(shù)量不夠。非腺病毒包裝細胞被腺病毒感染后是不會有什么明顯的特征。如果您在加入病毒的時候是提前把病毒用培養(yǎng)基稀釋混勻之后再加入培養(yǎng)皿中的,那么高MOI值(導(dǎo)致細胞飄起來)對于目的細胞是比較高的。因此,您不用擔(dān)心,可以先檢測一下是否有蛋白表達。
2. 腺病毒感染細胞后是否需要更換新鮮培養(yǎng)液?
是否需要更換新鮮培養(yǎng)液需要看加入病毒的量,病毒量多的時候會對細胞有毒性:如果鏡檢時看到細胞狀態(tài)有變化,需要在4-8h左右更換新鮮培養(yǎng)液;如果鏡檢時看到細胞狀態(tài)無明顯變化,那么病毒感染細胞之后就無需更換新鮮培養(yǎng)液?;蛘?,如果您擔(dān)心病毒長時間作用于細胞會有毒性,也可在12h后更換新鮮培養(yǎng)液。
3. 腺病毒感染細胞4-6h之后發(fā)現(xiàn)細胞全部飄起來了,請問這是怎么回事?
造成上述現(xiàn)象的原因主要有三點:
1)細胞的狀態(tài):感染之前鋪板的細胞一定要使用健康的細胞;
2)實驗操作不當(dāng):在加入病毒液的時候,如果局部病毒濃度過高會導(dǎo)致細胞死亡。因此,我們建議將病毒和培養(yǎng)基混勻之后再加入細胞中。
3)如果以上2點均無誤,那就是加入的病毒量太大了。
4. 腺病毒感染細胞時,加入病毒量的依據(jù)是什么?
要得到最佳實驗結(jié)果,確定腺病毒的最適用量是關(guān)鍵。量不足達不到100%感染效率;量太高則會對細胞產(chǎn)生毒性。那么如何確定呢?"感染復(fù)數(shù)"(MOI,multiplicity of infection)起著決定作用。MOI是是感染時病毒與細胞數(shù)量的比值。不同細胞系細胞表面的腺病毒受體數(shù)量不同,這就決定了不同細胞系的MOI會有所不同。通常,易感染細胞系所使用的MOI范圍為10-100。 但是,對于某些難感染的細胞系,MOI可能需要高達1000。對于大多數(shù)細胞系來說,最佳MOI的范圍很窄。我們建議您查閱文獻或者在正式實驗前,在目的細胞中用報告基因的腺病毒進行預(yù)實驗摸最佳MOI。
最適病毒用量的計算公式:
病毒用量pfu=最佳MOI×細胞數(shù)目/病毒滴度
例如, 如果您目的細胞的最佳MOI=10,您需要感染106的細胞,那么您共計需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度為1×1010 pfu/mL, 那么您實驗需要的病毒量就是1ul.
5. 腺病毒感染細胞之后多久可以從基因水平和蛋白水平檢測表達?如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白,檢測時間是否有區(qū)別?
腺病毒攜帶的目的基因表達快。如果您想從基因水平檢測基因的表達,那么在病毒感染細胞12-24h之間進行檢測;如果您想從蛋白水平檢測基因的表達,那么在病毒感染細胞48-72h之間進行檢測。
對于分泌性蛋白和非分泌性蛋白,檢測時間一樣。如果擔(dān)心蛋白分泌出來,也可以將培養(yǎng)基也一起帶著做western blot。
6. 腺病毒毒種被細菌污染了,沒有多余毒種,也沒有構(gòu)建好的載體,怎么辦?
因為腺病毒的直徑大小是90-100nm,而細菌的直徑大小要大的多,可以用22um的濾器進行過慮。如果您的病毒量很低,擔(dān)心過慮后損失太多,無法進行后面的擴增工作,您可以先用污染了細菌的腺病毒直接擴增,當(dāng)然擴增的結(jié)果是得到了污染了細菌的腺病毒,但病毒的量會提高一些,這樣再用22um的濾器進行過濾。
7. 如何鑒定腺病毒遞送的目的基因?
可以按照如下方法進行鑒定:
①針對基因設(shè)計引物,同時作為擴增和測序引物;
②將病毒用蛋白酶K處理后做為模板,如果是未純化的病毒還需要過純化柱處理掉培養(yǎng)基的成分;
③以處理過的病毒為模板進行PCR;
④用PCR引物對PCR產(chǎn)物測序。
8. 慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒三種病毒有什么區(qū)別?如何選擇?
對于轉(zhuǎn)染困難的細胞,科研工作者通常會選擇病毒來導(dǎo)入目的基因。目前,腺病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒是常用的病毒載體工具。那么如何選擇適合您實驗體系的病毒工具,請參考下面3種病毒工具的比較:
病毒表達系統(tǒng) |
腺病毒 |
腺相關(guān)病毒 |
慢病毒 |
病毒基因組 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA |
病毒外殼 |
無 |
無 |
具有包膜蛋白 |
基因組大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
包裝容量 |
7.5kb |
4.7kb |
6kb |
感染的細胞類型 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
分裂細胞和非分裂細胞 |
整合至宿主基因組 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
表達豐度 |
高水平表達 |
高水平表達 |
中到高水平表達 |
表達時間 |
快(1-2天) |
1-2周(體內(nèi)) |
慢(2-4天) |
外源基因持續(xù)表達時間 |
短暫 |
潛在的持久 |
長久 |
免疫反應(yīng) |
較高 |
極低 |
低 |
相對病毒滴度 |
10E10pfu/mL |
10E13VG/mL |
10E8TU/mL |
生物安全等級 |
BSL-2 |
BSL-2 |
BSL-2 |
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ORF現(xiàn)貨腺病毒:
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
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8. |
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9. |
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10. |
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11. |
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12. |
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13. |
MicroRNA現(xiàn)貨腺病毒:
1. |
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2. |
基因過表達方面:
1. |
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2. |
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3. |
J Cell Physiol.? (IF=5.546) . Wang M, et al. (2021) . Lack of Mof reduces acute liver injury by enhancingtranscriptional activation of Igf1. [過表達/干擾 急性肝損傷] |
|
4. |
Front Cell Dev Biol.? (IF=5.201) . Gu J, et al. (2021) . CFTR Deficiency Affects Glucose Homeostasis via Regulating GLUT4 Plasma Membrane Transportation. [過表達 成肌細胞] |
|
5. |
Front Immunol.? (IF=5.085) . Wu L, et al. (2021) . EZH2 Inhibition Interferes With the Activation of Type I Interferon Signaling Pathway and Ameliorates Lupus Nephritis in NZB/NZW F1 Mice. [過表達 狼瘡腎炎] |
|
6. |
[4]Oxid Med Cell Longev.? (IF=5.076) . Gao Y, et al. (2021) .Rap1GAP Mediates Angiotensin II-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy by Inhibiting Autophagy and Increasing Oxidative Stress. [過表達 心肌] |
|
7. |
J Cell Mol Med.? (IF=4.486) . Lei W,et al. (2021) . MARCH5 restores endothelial cell function against ischaemic/hypoxia injury via Akt/eNOS pathway. [過表達 心肌] |
|
8. |
J Biol Chem.? (IF=4.238) . Zhang Z,et al. (2021) . The adaptor protein GIPC1 stabilizes the scavenger receptor SR-B1 and increases its cholesterol uptake. [過表達/干擾 肝臟] |
|
9. |
J Anim Sci Biotechnol.? (IF=4.167) . Liu J, et al. (2021) . Comprehensive evaluation of the metabolic effects of porcine CRTC3 overexpression on subcutaneous adipocytes with metabolomic and transcriptomic analyses. [過表達 脂肪細胞] |
|
10. |
Aging. (IF=4.831) .Chen Y, et al. (2020). Mitophagy impairment is involved in sevoflurane-induced cognitive dysfunction in aged rats[自噬雙標 術(shù)后認知功能障礙]. |
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11. |
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12. |
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13. |
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14. |
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15. |
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16. |
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17. |
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18. |
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19. |
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20. |
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21. |
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22. |
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23. |
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24. |
基因沉默方面:
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
基因編輯方面:
1. |
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2. |
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3. |
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