現(xiàn)貨產(chǎn)品
病毒包裝
克隆服務(wù)
技術(shù)資源
關(guān)于維真
熒光素酶(luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱,可以催化熒光素氧化成氧化熒光素,在氧化過(guò)程中發(fā)出生物熒光。熒光素酶以出色的靈敏度、使用方便、可定量檢測(cè)成為理想的報(bào)告基因。熒光素酶的種類(lèi)很多,其中應(yīng)用較為廣泛的是螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly luciferase,F(xiàn)LUC)和海腎熒光素酶(Renilla luciferase,RLUC)。
■ 螢火蟲(chóng)熒光素酶是一個(gè)61kD的單體酶,不需要表達(dá)后修飾即可獲得酶活性,其催化的發(fā)光反應(yīng)必須要有ATP和熒光素的參與,在ATP、Mg2+和O2存在的條件下,熒光素在熒光素酶的催化下氧化產(chǎn)生黃綠光,波長(zhǎng)540-600nm。
■ 海腎熒光素酶是一個(gè)36kD的單體酶,同樣不需要表達(dá)后修飾即可產(chǎn)生酶活性,只需要O2即可催化腔腸素氧化發(fā)出藍(lán)光,波長(zhǎng)460-540nm。
由于螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的催化底物和發(fā)光顏色不同,且光吸收波長(zhǎng)不同,可在互不干擾的情況下進(jìn)行檢測(cè),此外,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)兩種酶均無(wú)內(nèi)源性表達(dá),因此作為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)得到廣泛使用。在雙熒光素酶檢測(cè)中,通常以螢火蟲(chóng)熒光素酶為實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因,以海腎熒光素酶為對(duì)照?qǐng)?bào)告基因,以減少細(xì)胞活性、轉(zhuǎn)染效率等外在變化因素對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響。
將螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒與帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,或者將兩種報(bào)告基因構(gòu)建到同一載體上,用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá),通過(guò)計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測(cè)值與海腎熒光素酶檢測(cè)值的比值(Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase),分析熒光素酶的表達(dá)水平。
雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)憑借靈敏度高、檢測(cè)范圍廣、方便快速的優(yōu)勢(shì),已成為基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析、啟動(dòng)子SNP分析和非編碼RNA靶向互作等研究的重要手段。
將靶啟動(dòng)子片段插入到螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)序列上游,構(gòu)建實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因質(zhì)粒,將要檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與兩種報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染相關(guān)細(xì)胞;經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后裂解細(xì)胞,離心取上清,隨后分別加入兩種熒光素酶底物,熒光素酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光,通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度測(cè)定熒光素酶的活性,從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否與該啟動(dòng)子存在相互作用。
備注:如果轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子,則螢火蟲(chóng)熒光素酶基因就會(huì)表達(dá),且螢火蟲(chóng)熒光素酶的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
相關(guān)載體:
miRNA通過(guò)識(shí)別mRNA的3’UTR區(qū),誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)沉默復(fù)合體介導(dǎo)的mRNA降解或抑制mRNA的翻譯過(guò)程。將野生型或突變型待測(cè)靶基因的3’UTR序列構(gòu)建至螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的3’端,將兩個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒與miRNA在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá),通過(guò)比較螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)活性的改變,驗(yàn)證miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控作用。
備注:若螢光素酶的活性降低,提示miRNA可能參與抑制靶基因的表達(dá)。
相關(guān)載體:
服務(wù)流程: