項(xiàng)鵬/夏凱團(tuán)隊(duì)通過(guò)AAVDJ基因治療恢復(fù)LCF小鼠的自然生育能力并改善身體功能
文章標(biāo)題：AAV-mediated gene therapy restores natural fertility and improves physical function in the Lhcgr-deficient mouse model of Leydig cell failure
發(fā)表期刊：CELL PROLIFERATION
合作客戶：中山大學(xué)項(xiàng)鵬/夏凱研究團(tuán)隊(duì)
AAVDJ轉(zhuǎn)染睪丸細(xì)胞的效率最高
研究背景
睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells，LC）負(fù)責(zé)男性95%以上的睪酮合成和分泌，對(duì)男性表型、內(nèi)分泌穩(wěn)態(tài)和生殖功能的發(fā)展和維持必不可少。然而，與睪酮合成相關(guān)的關(guān)鍵基因的有害突變會(huì)導(dǎo)致睪酮水平降低，最終導(dǎo)致睪丸間質(zhì)功能衰竭（LCF）。以往的研究表明AAV8介導(dǎo)的基因治療在Lhcgr缺陷小鼠模型中顯示出對(duì)LCF的治療潛力，然而，基因治療的小鼠仍然不能自然生育后代，表明經(jīng)AAV8治療小鼠的睪酮和精子發(fā)生適度恢復(fù)仍然不足以支持自然生育能力。本研究對(duì)AAV血清型進(jìn)行了廣泛篩選，以確定對(duì)LC細(xì)胞祖細(xì)胞靶向效率更強(qiáng)的載體，并評(píng)估了AAV介導(dǎo)的基因治療對(duì)LCF小鼠睪酮水平、性發(fā)育和精子發(fā)生的影響。
研究方法與結(jié)果
1、AAVDJ-Lhcgr有效靶向LC祖細(xì)胞，并促進(jìn)Lhcgr-/-小鼠生殖器官發(fā)育
將11種不同衣殼的AAVs（AAV1、2、5、6、7、7m8、8、9、rh10、anc80和DJ），以不同劑量注射到小鼠睪丸間質(zhì)中，熒光觀察發(fā)現(xiàn)AAVDJ驅(qū)動(dòng)睪丸內(nèi)最有效的基因表達(dá)，與AAV8相比，AAVDJ在Leydig細(xì)胞祖細(xì)胞中表現(xiàn)出更高的感染效率；并且經(jīng)AAVDJ-Lhcgr治療后，Lhcgr-/-小鼠睪丸中Lhcgr的表達(dá)水平和血清睪酮濃度明顯增加，LCs功能也得到顯著恢復(fù)。進(jìn)一步評(píng)估發(fā)現(xiàn)AAVDJ-Lhcgr治療顯著改善了Lhcgr-/-小鼠的生殖器官參數(shù)，有效重啟了小鼠生殖器官的發(fā)育。隨后研究團(tuán)隊(duì)確定了AAVDJ-Lhcgr療法是否可以挽救Lhcgr-/-小鼠的精子發(fā)生，組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)AAVDJ治療組（8x109 gc/睪丸）的睪丸曲精管直徑擴(kuò)大，精子發(fā)生明顯，且睪丸中存在成熟精子，精子數(shù)量和活力顯著增加。
AAVDJ-Lhcgr重啟Lhcgr-/-小鼠的性發(fā)育并挽救精子發(fā)生
2、AAVDJ-Lhcgr恢復(fù)Lhcgr-/-小鼠生育能力使其產(chǎn)生可生育后代
為了評(píng)估基因治療后Lhcgr-/-小鼠的生育能力，在AAVDJ-Lhcgr（8x109 gc/睪丸）治療后4周，將雄性Lhcgr-/-小鼠與Lhcgr+/+雌性小鼠共同飼養(yǎng)進(jìn)行繁殖，6周后，有2只Lhcgr+/+雌性小鼠分別產(chǎn)下5窩和7窩后代，基因分型分析證實(shí)，檢測(cè)的五只代表性幼崽均為雜合子。進(jìn)一步的PCR證實(shí)AAVDJ不整合到生殖細(xì)胞的基因組中。隨后，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)通過(guò)AAVDJ-Lhcgr基因治療產(chǎn)生的F1是否能產(chǎn)生F2進(jìn)行了驗(yàn)證，將F1中的五只成年雄性和五只雌性與相應(yīng)的Lhcgr+/+小鼠交配，結(jié)果表明所有F1小鼠都能夠通過(guò)自然交配產(chǎn)生F2，并且表現(xiàn)出與Lhcgr+/+小鼠相當(dāng)?shù)恼Ｉ芰?。上述結(jié)果證明AAVDJ-Lhcgr治療的Lhcgr-/-小鼠通過(guò)自然交配能夠產(chǎn)生可生育的后代。
AAVDJ-Lhcgr恢復(fù)Lhcgr-/-雄性小鼠的生育能力并產(chǎn)生可生育后代
3、AAVDJ-Lhcgr改善Lhcgr-/-小鼠的脂肪和肌肉功能并促進(jìn)骨形成
先前的研究表明睪酮水平低與體脂增加、肌肉質(zhì)量減少和肌肉功能受損等身體不良影響有關(guān)，因此研究人員檢測(cè)了AAVDJ-Lhcgr治療對(duì)Lhcgr-/-小鼠這些參數(shù)的影響。組織學(xué)分析顯示，與PBS治療的小鼠相比，AAVDJ-Lhcgr治療的Lhcgr-/-小鼠的附睪脂肪體重比顯著降低，附睪脂肪細(xì)胞體積較小；脛骨前肌重量及橫截面肌纖維面積明顯增加。握力測(cè)試發(fā)現(xiàn)AAVDJ-Lhcgr治療組小鼠表現(xiàn)出比PBS治療組小鼠更大的握力，并且懸掛時(shí)間增加，表明基因治療后小鼠肌肉耐力增強(qiáng)；跑步機(jī)測(cè)試顯示，AAVDJ-Lhcgr組小鼠的運(yùn)動(dòng)能力顯著提高。這些發(fā)現(xiàn)證明了AAVDJ-Lhcgr治療對(duì)Lhcgr-/-小鼠體脂減少、肌肉質(zhì)量增強(qiáng)和肌肉功能改善的有益作用。進(jìn)一步研究表明基于AAVDJ的基因治療有望通過(guò)抑制骨髓脂肪積聚和促進(jìn)Lhcgr-/-小鼠的骨形成來(lái)保護(hù)骨骼穩(wěn)態(tài)。
AAVDJ-Lhcgr改善Lhcgr-/-小鼠的脂肪和肌肉功能并促進(jìn)骨形成
結(jié)論
本研究證明了AAVDJ介導(dǎo)的基因治療作為一種有前景的LCF治療方法的有效性和安全性。即使在相對(duì)較低的劑量下，AAVDJ基因治療也能顯著提高Lhcgr-/-小鼠的血清睪酮水平，顯著改善性發(fā)育，并部分促進(jìn)精子發(fā)生。重要的是，AAVDJ介導(dǎo)的基因治療使Lhcgr-/-小鼠能夠通過(guò)自然交配恢復(fù)生育能力，從而產(chǎn)生可育后代。此外，這種治療方法有效地改善了Lhcgr-/-小鼠的脂肪、肌肉和骨骼功能。這些發(fā)現(xiàn)為靶向遺傳性LCF或其他生殖疾病的基因療法的潛在臨床應(yīng)用提供了有力證據(jù)。
